2018 Fiscal Year Annual Research Report
細胞－細胞小器官－分子の階層を貫く流れ刺激感知の力学的理解
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17J03032
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
牧 功一郎 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | メカノバイオロジー / クロマチン / DNA損傷 / 静水圧 / 関節軟骨 / 材料力学 / 機械工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成３０年度は，ヘルシンキ大学ライフサイエンス研究所Sara Wickstrom 研究室との共同研究において，以下の実験検討を行った．
・マウス軟骨細胞の単離および不死化 マウスからの初代軟骨細胞の単離および不死化実験を行った．qPCR法による遺伝子発現の解析を行った結果，マウス癌腫由来のセルラインATDC5に比して，本研究で樹立した軟骨細胞セルラインはCol2などの軟骨細胞マーカーの発現が数百倍高いことが明らかとなった．さらに，インスリン添加による分化誘導およびアルシャンブルー染色を行った結果，インスリンを添加した細胞においてより明るい染色結果が得られた．このことから，樹立した軟骨細胞セルラインは軟骨細胞としての特徴をもつ一方，より成熟した軟骨細胞への分化が可能な状態を有することが示唆された．
・静水圧作用下におけるDNA損傷に関する検討 軟骨細胞セルラインに対して静水圧を負荷した結果，ATDC5細胞で得られた結果と同様に，静水圧の作用下でDNAの損傷が生じることが明らかとなった．さらに，EdUラベリングによる検討を行った結果，静水圧のもとでDNAの複製が抑制されることが観察された．さらに，DNA損傷を誘導するEtoposideを添加した細胞においてDNA複製が抑制されたことから，静水圧の作用下で生じるDNA損傷がDNAの複製抑制を導くことが示唆された．
・静水圧作用下におけるクロマチン構造の変化に関する検討 ヘテロクロマチンの主要なマーカーであるメチル化ヒストンに対して免疫染色およびウェスタンブロットを行った．その結果，静水圧の下でメチル化ヒストンが減少することが明らかとなった．また，さらに，EUラベリングによる検討を行った結果，静水圧の下でRNAの合成が活性化することが明らかとなった．このことから，ヘテロクロマチンの不安定化により転写が活性化される可能性が示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では，関節軟骨に存在する軟骨細胞を取り上げ，その力学感知機構を細胞‐細胞小器官－分子のスケールで統一的に明らかにすることを目的としております．研究実施前の検討では，軟骨細胞に負荷される力学的刺激として流れに着目しておりましたが，当研究室にて保有する力学負荷装置の独自性および生物学的重要性の観点から，静水圧刺激に対する生理的応答に関する研究を進めることといたしました．
平成３０年度の研究においては，ヘルシンキ大学との共同研究を進めるべく，現地にてマウス軟骨細胞の単離・不死化実験，および，静水圧装置のセットアップを行いました．樹立した軟骨細胞セルラインに対して静水圧を負荷した結果，ヘテロクロマチンからユークロマチンへの遷移が進むこと，転写が活性化すること，さらに，DNA損傷を介してDNA複製が抑制されることなどが明らかとなってまいりました．このような応答は静水圧のもとでの軟骨細胞の遺伝子発現の制御，および，ゲノム情報の防御に重要な役割を果たしていると考えられます．
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| Strategy for Future Research Activity |
現在，本研究に関してハイインパクトジャーナルへの投稿を準備しており，ATACシーケンシングなどの最先端テクノロジーを駆使して研究を成熟させる予定です．特に，クロマチン構造の変化がDNA損傷および転写の活性化に与える効果を探るため，ヒストン３メチル化酵素のノックダウンを行った細胞に対してDNA損傷のマーカ―であるリン酸化ヒストンrH2AXおよび転写活性の指標であるリン酸化RNAポリメラーゼRNA pol2 S2p の変化を確認いたします．さらに，静水圧のもとでクロマチン構造に変化が生じる最上流のメカニズムを探るため，ヘテロクロマチンの構造を形成する核となるタンパク質の静水圧のもとでの振る舞いをin vitro の系で１分子レベルで確認する予定です．以上の検討をもって，静水圧の下で軟骨細胞の遺伝子発現が制御される基礎的な物理メカニズムおよびゲノム情報が防御されるメカニズムの解明を目指します．
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