2017 Fiscal Year Annual Research Report
X染色体不活性化機構の解明に向けた人工染色体の活用
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17J03813
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
稲岡 大悟 鳥取大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | Xist / lncRNA / 人工染色体 / X染色体不活性化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、Xist long noncoding RNA (lncRNA)がX染色体不活性化(XCI)現象を引き起こす際に、シスエレメントとして反復配列であるLINE (1ユニット)を必要とするか検討する、人工染色体を用いることで初めて明らかになるテーマである。
本年度は、マウス人工染色体上(MAC)に搭載したXist遺伝子(Xist-MAC)がXCIを再現できるか検討する目的で、①Xist-MAC保持マウスES細胞の作製と、②LINE配列をMAC上に搭載した上でのLINE Xist-MAC保持マウスES細胞の作製、③それらの細胞の不活性化評価を実施した。
①CHO細胞内に保持させているXist-MACを、微小核細胞融合法を用いてマウスES細胞に移入し、核型解析と薬剤によるXist RNA誘導の確認(qRT-PCR)、RNA-FISHによるXist-RNAの集積確認を行った。現在までのところ、Xist-MACを二本保持しているクローンしか樹立できていないが、Xist RNAによる不活性化評価を実施した。
②CHO細胞内に保持させているXist-MACに対し、LINE配列(L1)をゲノム編集技術(CRISPR/Cas9システム)を用いて導入後、微小核細胞融合法によりマウスES細胞へ移入した。クローン化出来たものに関して、核型解析と薬剤によるXist RNA誘導の確認(qRT-PCR)、RNA-FISHによるXist-RNAの集積確認を行った。こちらについては、正常核型かつLINE Xist-MACを１本保持しているクローンを３種樹立することに成功した。
③樹立したそれぞれのクローン(Xist-MAC、LINE Xist-MAC)を分化誘導し、XCIの評価をqRT-PCRで実施したところ、共に人工染色体上の遺伝子の発現抑制をしている結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、LINEとXistゲノム領域を保持させた人工染色体の作製(LINE Xist-MAC)とLINE Xist-MACを保持するマウスES細胞の樹立および樹立細胞におけるXist lncRNAの不活性化能評価を計画していた。LINE Xist-MAC保持マウスES細胞については、人工染色体の作製と細胞の樹立、不活性評価を全て完了した。また、そのコントロール細胞となるXist-MAC保持マウスES細胞については正常クローン(Xist-MAC 1本保持)が取れていないものの、Xist-MACを２本保持している細胞を獲得し、不活性評価を実施した。
本年度の進捗は、研究計画とほぼ同等の内容であり、コントロール細胞についても樹立の目処がたっていることから上記の通り評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、コントロール細胞となる正常核型のXist-MAC保持マウスES細胞を樹立し、Xist lncRNAの不活性化能評価を実施する。加えて、Xist lncRNAによる人工染色体上のヒストン修飾変化を追跡するため、ChIP assayを実施する。不活性マーカーであるH3K27me3など、XCIのマーカーになるヒストン修飾が人工染色体上にあることを確認し、XCIが真に模倣できていることを示す。これらの結果がLINEの有無で変化するかを比較することで、XCIにおけるLINEの必要性を検証する。
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Research Products
(1 results)
