2017 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトヘルペスウイルス6感染に必須であるテグメントタンパク質U11の機能解析
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17J05170
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Research Institution | Kobe University |
Principal Investigator |
王 博超 神戸大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
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Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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Keywords | HHV-6 / テグメントタンパク質 / タンパク質間相互作用 |
Outline of Annual Research Achievements |
ヒトヘルペスウイルス6 (HHV-6) のテグメントタンパク質であるU14 及びU11 はヘルペスウイルス特有のテグメント構造を構成するタンパク質であり、それぞれウイルス感染において必須であることが我々のグループによって証明されている。我々はX線結晶構造解析の方法を用いてU14 の立体構造を決定しており、U14の構造上にU11 と相互作用する領域を同定した。この領域では、U11と相互作用するアミノ酸残基として、以前我々のグループがU14の機能に重要であることを見出した三つ連続のアミノ酸424-426に加えて、二つのアミノ酸残基が関与している可能性が新たに示唆された。平成29年度はこのU14上のU11と相互作用する領域について、免疫沈降法と変異ウイルスの作製及び解析により検証を行った。 この二つのアミノ酸残基のコドンを他に置換したU14 変異体の発現プラスミドを作製し、免疫沈降実験により、置換によるU11 との相互作用への影響を解析した。その結果、片方をアラニンに変異させたことで、UI4 とU11の相互作用が減弱したが、もう片方では、U11との相互作用は維持されている事が示された。 免疫沈降の結果を参考として、変異HHV-6を作製した。U14 に変異を持つウイルスゲノムDNAを作製し、HHV-6 感受性細胞に導入することでウイルスの再構築を試みた。その結果、ウイルス再構築は見られたが、ウイルスの増殖能が減弱していた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度の研究計画においては、まずU14 N末端領域の構造解析から見出された二つのアミノ酸残基が、実際にU11との相互作用に関わるか否か、そしてウイルスの感染及び増殖おいてどのような影響をもたらすかを解析した。以前U11との相互作用に関わることが見出された機能部位424-426 のアミノ酸側鎖はU14 の構造表面に露出している。新たに見つけたアミノ酸残基も疎水性の側鎖を持ち、これらの側鎖はU14 の表面に疎水性領域を形成しており、この疎水性領域がU11 との相互作用に重要であることが示唆された。この二つのアミノ酸残基を変異させて実際に解析した結果、片方の変異によりU11との相互作用が減弱したことから、このアミノ酸残基は実際にU11との相互作用に関与する事が示された。一方で、もう片方の変異ではU11 との相互作用は維持されていたことから、U11の相互作用には必要ではないと考えられる。しかし、U11 との相互作用が増強している可能性も示唆されたため、さらなる解析が必要である。さらにU11との相互作用に関与する方に変異を持つウイルスでは、ウイルス粒子の再構築は見られたが、野生型と比べ、その増殖能に大きな障害が生じていたことから、テグメントタンパク質であるU14 とU11 との相互作用がウイルスの増殖において重要であることが示された。 以上から、本年度は計画に沿って実験を行い、おおむね期待通りの結果が得られた。
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Strategy for Future Research Activity |
U14 に関して、U11との相互作用に関わる新たに見出されたアミノ酸残基に変異を持つウイルスでは増殖能に大きな障害が生じたことから、 U14 とU11 との相互作用はウイルスのテグメント構造の形成に重要であると考えられる。テグメント形成障害の一つ表現型として、感染細胞内に大量な未成熟なウイルス粒子が観察される可能性があるため、今後はこのU14変異体ウイルスの感染細胞に関して電子顕微鏡解析を行い、ウイルス粒子の性状を解析する。 一方、U11上のU14と相互作用する領域に関してはU11の配列解析を行った結果、U11は、HHV-6 と同じくβヒトヘルペスウイルス亜科に属するヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のテグメントタンパク質pp150 と相同性を有することが示された。この相同性はU11、pp150双方のN 末端領域の約200 アミノ酸のみに見られる。pp150 のN末端領域は近年クライオ電子顕微鏡解析によってウイルス粒子の内部でゲノムを内包するカプシドと結合することが報告されている。これらの事からU11 のN末端領域はpp150同様にカプシドと結合する可能性が高く、したがってU11のC末端領域がU14 と相互作用しテグメントの形成に関与すると考えられる。そこで今年度は、このU11 N末端領域をベースにそれ以降のC末端領域に着目し、その機能及び構造に関して解析を行う予定である。
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