2017 Fiscal Year Annual Research Report
生殖中枢を制御するエストロゲンの正負フィードバックを担う分子メカニズムの解明
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17J05577
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
堀畑 慶 名古屋大学, 生命農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | 生殖機能制御 / 神経内分泌 / エストロゲンフィードバック / キスペプチンニューロン / 不死化細胞 / ヒストン修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、生殖中枢を制御するエストロゲン（E2）の正負フィードバックを担う分子メカニズムの解明である。哺乳類の生殖中枢であるキスペプチンニューロンに着目して、E2によるKiss1発現およびキスペプチン分泌制御における分子メカニズムを解明するため、昨年度は以下の実験を遂行した。
①キスペプチンニューロン不死化細胞株のE2に対する反応性の検討および細胞内カルシウム濃度測定
分子メカニズムを解析するために有用な、生理的状態を反映するキスペプチンニューロン不死化細胞株の樹立を目指し、実験を行った。研究室において作出したラットキスペプチンニューロン不死化細胞株に対してE2を添加し、Kiss1発現を測定した。現在、複数ある候補株の中からE2に対する反応性を保持する株の選抜を進めている。また、キスペプチンニューロン不死化細胞株の神経活動を記録し、分泌への影響を調べるため、細胞内カルシウム濃度測定系の確立を目指し、ディッシュのコーティングや灌流液、測定時間等の条件検討を行なった。
②Kiss1発現またはキスペプチン分泌制御候補因子の選抜およびキスペプチンニューロンとの共存の検討
ヒストン修飾関連タンパク質であるRetinoblastoma-binding protein 7 (Rbbp7) がキスペプチンニューロンにおけるKiss1発現制御に関与するという仮説を立て、実験を行なった。ラット弓状核（ARC）および前腹側室周囲核（AVPV）の両神経核に局在する殆どのKiss1発現細胞において、Rbbp7遺伝子が発現することを発見した。また、神経伝達物質の開口分泌に関与するSNAREタンパク質について、RNAseqデータを精査することで、キスペプチン分泌制御に関与する可能性のある候補因子を絞った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「生殖中枢を制御するエストロゲンの正負フィードバックを担う分子メカニズムの解明」を目指して精力的に研究に取り組んだ。作出したラットキスペプチンニューロン不死化細胞株の中から、生理的状態を反映するキスペプチンニューロン不死化細胞株の検討を着実に進めている。さらに、当研究室所有のRNAseqデータを精査して、「ヒストン修飾関連タンパク質であるRbbp7がKiss1発現を制御する」という仮説を立て、弓状核（ARC）および前腹側室周囲核（AVPV）の両神経核に局在する殆どのKiss1発現細胞において、ヒストン修飾関連遺伝子であるRbbp7が発現することを発見した。現在、Rbbp7のキスペプチンニューロンにおける役割を明らかにするため、RNA干渉法によるRbbp7のノックダウンを計画し、準備している。また、「キスペプチン分泌制御にSNAREタンパク質が関与する」と仮説を立て、RNAseqデータを精査し、発現量から候補因子を絞ることができた。以上から、本研究はおおむね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究について、以下２つの推進方策を予定している。
①生理的状態を反映するラットキスペプチンニューロン不死化細胞株の選抜
昨年度に引き続き、残りの候補株にエストロゲン（E2）を添加し、Kiss1発現が変化する株の選抜を行う。また、神経活動を記録して分泌への影響を調べるため、ラット不死化細胞株における細胞内カルシウム濃度測定系を確立する。生理的状態を反映する不死化細胞株の選抜後は、Kiss1発現制御・キスペプチン分泌制御の候補因子について、E2有無条件下でRNA干渉法または阻害剤を添加することで、候補因子の作用を抑制し、Kiss1発現・キスペプチン分泌への影響を検討する予定である。
②Kiss1発現またはキスペプチン分泌制御因子の探索および機能解析
ヒストン修飾タンパク質であるRbbp7がキスペプチンニューロンに発現していることが示されたため、Rbbp7がKiss1発現制御に関与する可能性が高まった。今後は、in vitroおよびin vivoにおいて、RNA干渉法を用いてRbbp7発現をノックダウンし、Kiss1発現変化を検討することで、Kiss1発現制御におけるRbbp7の役割を明らかにする予定である。また、RNAseqデータをもとにキスペプチンニューロンに発現するSNAREタンパク質を絞り込めたため、これらのキスペプチン分泌制御候補因子についても検討していく計画である。
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Research Products
(4 results)
