2018 Fiscal Year Annual Research Report
放線菌由来新規ニトロ化酵素の同定と芳香族ジアミン生産系の開発
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17J06071
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
冨田 宏矢 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | 生合成 / 放線菌 / Streptomyces / シトクロムP450 / 天然物 / ニトロ化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度同定したチロシンニトロ化酵素RufOについて、その構造情報を得るため結晶構造解析を進めた。結晶は再現性よく得られたものの、活性中心を覆うループ部分の電子密度が観測されなかった。その原因として基質であるチロシンが活性中心に結合していないことが考えられた。そこで基質との共結晶化を行うため、チロシンやニトロチロシンおよびそれらのアナログ化合物を用いて実験を継続した。しかしながら、やはり活性中心への結合およびそれに伴うループの安定化は見られなかった。次にホモログ酵素を用いた解析を進めることを考え、データベースより発見したNonomuraea solani由来のタンパク質 (NsP450) を使用して研究を継続した。NsP450はRufOと比較的高い相同性を示し、rufO遺伝子破壊株にNsP450遺伝子を相補するとその表現型が回復したことから、NsP450もRufOと同じ機能を持つことを確かめた。ゲノム上でNsP450遺伝子の周辺にはrufomycinとは異なる二次代謝産物生合成遺伝子クラスター領域があることから、おそらくrufomycinとは異なるニトロチロシンを含む化合物の生合成に関与するものと思われる。続いてNsP450の結晶化条件の探索と確立を行ったのち、基質、生成物とそのアナログを用いて共結晶化を進めた。しかしRufOと同様、やはり活性中心のループ部分の電子密度は観察されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
結晶は得られたが活性中心の詳細な構造情報を取得するには至っておらず、反応機構の類推や基質特異性改変のためのアミノ酸残基の絞り込みができていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
RufOとNsP450について得られた構造情報を併せて考えることで、重要なアミノ酸残基を予測し、部位特異的変異導入などによって酵素活性や基質特異性がどのように変化するのかを調べていく。
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