2018 Fiscal Year Annual Research Report
ユビキチンリガーゼによる膜交通の制御を介した新規栄養応答制御機構の解明
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17J06430
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
長谷川 陽子 北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | ユビキチン化 / 膜交通 / 栄養応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，植物の膜局在型ユビキチンリガーゼATL31による，SNAREタンパク質を介した炭素（C）窒素（N）栄養応答制御機構の解明を目指して解析を進めている。昨年度までの解析で，ATL31の相互作用因子であるTGN局在型SNAREタンパク質SYP61が，シロイヌナズナの高C/低Nストレス応答制御に関わることを，機能抑制変異体を用いた解析によって明らかにした。また， in vitroにおいてSYP61がATL31によってK63タイプのユビキチン化修飾を受けること，植物体内においてもSYP61がK63タイプのユビキチン化を受けることを明らかにした。これらのことから，ATL31がSYP61を介して積荷の輸送を制御することで，植物のC/N栄養応答を制御している可能性が考えられた。
今年度は，ATL31-SYP61複合体によって輸送を制御される積荷の網羅的な同定を目指して分画プロテオミクスを実施した。具体的には，野生型およびatl31の機能欠損変異体背景でGFPタグ付SYP61を発現する植物体を異なるC/N条件にさらし，粗抽出液をスクロース密度勾配遠心によって分画し，精製された膜画分をGFP抗体で免疫沈降することで，SYP61が存在する輸送小胞を単離した。作製したサンプルについて，現在委託先においてプロテオミクスを実施している。また，SYP61のユビキチン化の生理的意義や細胞内局在性への影響を検証するために，ユビキチン化部位の同定を試み，ユビキチン化サイト変異型SYP61を発現する植物体の作出を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の解析の要であった分画プロテオミクスについて，委託先の機器トラブルによる若干の遅延があったが，次年度の初めには結果を得られる予定であり，おおむね順調に進んでいる。
また，ユビキチン化部位変異型SYP61の発現植物体の作出も，昨年度に引き続いて順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
プロテオミクスの結果を解析し，C/N条件およびATL31の有無によって検出量が変化したタンパク質を積荷の候補として同定する。得られた候補について，変異体を用いた生理学的解析や， ATL31やSYP61の変異体におけるC/N栄養条件に応じた細胞内局在性の解析を行うことで，C/N栄養応答への寄与を検証する。
また，ユビキチン化部位変異型SYP61を発現する植物体を用いて，生理学的解析，細胞内局在性の解析，および共免疫沈降によるSNARE複合体形成への寄与の検証などを行うことで，SYP61ユビキチン化の生理学的および分子機能的意義を明らかにする。
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