2018 Fiscal Year Annual Research Report
葉緑体光定位運動における新規因子の同定と信号伝達分子メカニズムの解明
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17J06717
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
比嘉 毅 大阪大学, 蛋白質研究所, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | 葉緑体運動 / 光受容体 / フォトトロピン / CHUP1 / 生化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は植物細胞の持つ葉緑体が、光合成効率を高めるために弱い光に集まり（集合反応）、逆に強すぎる光から逃れることでその損傷を防ぐ（逃避反応）、葉緑体光定位運動という現象について、未知の制御因子の同定と信号伝達のメカニズムを明らかにすることを目的としている。前年度までに、葉緑体光定位運動研究においてこれまで試みのなかった生化学的なアプローチを出発点として、59に及ぶ新規制御因子の候補となるタンパク質を同定し、これらタンパク質を欠いたT-DNA挿入変異体の種子を取得した。本年度は主に、これら変異体において葉緑体光定位運動に影響のあるものを探索すべく、スクリーニングを行なった。
バンドアッセイは葉にスリット状に弱光、または強光を照射して、葉緑体の局在変化を促し、葉の色変化によって葉緑体光定位運動の有無を検討する方法である。この方法を用いた変異体スクリーニングでは、残念ながら反応が損なわれた変異体は見られなかった。そのため次に、プレートリーダーを用いた葉の赤色光透過率測定による変異体スクリーニングを行なった。この方法では弱光、強光の照射によって細胞内の葉緑体の局在が変化し、結果として変動する葉全体における赤色光の透過率を継時的に測定することで、葉緑体光定位運動をより詳細に評価することが可能である。しかしながらこの方法でも、葉緑体の反応性が明らかに低下した変異体は見られなかった。
今回、一遺伝子の欠損により葉緑体光定位運動が大きく影響を受けるものは見られなかったが、候補因子の中には過去に葉緑体光定位運動への関与の可能性を指摘されている細胞骨格制御のタンパク質なども含まれている。これらに関しては同一のタンパク質ファミリーに属する複数の因子が冗長的な制御を行なっている可能性が考えられ、今後は多重変異体における反応性の評価や、それらの因子の細胞内局在の観察を足がかりとして解析を進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の主な目標であった、葉緑体光定位運動制御の候補因子についての変異体スクリーニングについて、バンドアッセイおよび光透過率測定法ともに、全て終了した。当初はこれら候補因子の変異体の中に、葉緑体の反応性が低下したものが含まれることを期待していたが、残念ながらそのような変異体は見られなかった。今後、多重変異体での解析が待たれる。
また本年度は、phot2の細胞内局在を人為的に制御した形質転換植物についての実験が並行して行われた。phot2は主に細胞膜に局在しているが、一部葉緑体膜上にも観察される。この局在の異なるphot2について、葉緑体から離れた弱光被照射部に集合する反応では細胞膜上のphot2が、葉緑体が直接受ける強光から逃避する反応では葉緑体膜上のphot2がそれぞれ制御を行っているという考察がなされているが、それを決定づける研究はなされていない。九州大学の後藤英治助教は細胞膜、および葉緑体膜それぞれに局在を限定したphot2を発現する植物体を作成し、phot2が制御する種々の生理反応の観察を行なっている。
異なる局在を示すphot2が、集合反応および逃避反応それぞれを制御するならば、細胞膜上のphot2および葉緑体膜上のphot2それぞれの相互作用因子を同定することは、本研究課題の進展の上でも非常に意義深い。そこで本年度は、後藤助教が作成した形質転換植物の葉の葉肉細胞において、実際にその局在がうまくコントロールされていることを共焦点顕微鏡を用いた観察によって明らかにした。また、現在はそれら植物から得られたプロトプラストを出発材料として、細胞膜および葉緑体膜画分におけるphot2タンパク質の局在を免疫学的に検証する実験を進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に同定した葉緑体光定位運動制御の候補因子群の中で、同一のタンパク質ファミリーに属するものについて多重変異体を作成し、光透過率測定法により葉緑体光定位運動への影響を確認する。
それと並行して、プロトプラストにおける一過的な発現系を利用した細胞内、特に葉緑体周辺での候補因子タンパク質の局在を、蛍光タンパク質を指標として観察する。また、BiFC法を用いてphotやCHUP1といった既知の葉緑体光定位運動制御因子との相互作用の有無を確認し、集中的に解析を進めていく因子を絞り込む。
最終的にはその因子を欠いた変異体において、葉緑体の挙動や、葉緑体特異的なアクチン繊維（cp-アクチン繊維）の動態の詳細な観察を行う。また、異なる光環境やphotの存在、非存在下での候補因子のリン酸化状態の観察などを経て、その機能の解析を行う。
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