がん微小環境における細胞間シグナル伝達機構の解明

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17J07950
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 金城 智章 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2017-04-26 – 2020-03-31
• Keywords: 光遺伝学 / ライブイメージング / 腫瘍微小環境

Outline of Annual Research Achievements

がん細胞は、周囲の微小環境に存在する免疫・線維芽細胞などの間質細胞との相互作用により、増殖・転移・浸潤能を獲得することが知られている。生体内でがん細胞と間質細胞の分子活性を一細胞レベルで観察および操作する技術を開発し、がん間質細胞が、がん細胞の増殖や転移能に及ぼす影響とその分子機構を明らかにすることを目的として研究を行った。
まず、がん細胞または間質細胞特異的に分子シグナルを操作するため、青色光照射によりヘテロ二量体を形成する光遺伝学ツールであるCRY2-CIBNシステムを用いて、光誘導性にRaf-MAPK活性を誘導出来るマウスを作成した。生体マウスの耳の皮膚で光刺激を行ったところ、一光子励起ではシグナル活性化が可能であったが、ニ光子励起で本システムを活性化するためには、細胞に強い光毒性が生じる程度の強力な光を照射する必要があることが明らかになった。
そこで、青色光誘導性の光遺伝学ツールであるCRY2はニ光子励起効率が低いことが判明したため、融合蛋白やリンカー等を改良することにより、ニ光子励起で活性化しやすい新規光遺伝学ツールの開発に成功した。
最後に、新規光遺伝学ツールがマウスin vivoで使用可能かどうかを検証するため、同遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作成し、ERKバイオセンサーを発現するマウスとの交配を行った。同マウスの、耳の皮膚基底細胞においてERK活性イメージングと、単一細胞におけるニ光子励起を行い、マウス生体内においてRas-MAPKの活性を一細胞レベルで操作することが可能であることを示した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ニ光子励起で活性化可能な光遺伝学ツールの作成に成功した。当初の計画であったがん微小環境において間質細胞の役割を解析するにあたり、光遺伝学のツールを用いて間質細胞におけるERK活性化を誘導することで、がん細胞の形質を変化させうるかを検証することを試みた。光誘導性に二量体を形成するCRY2-CIBNを用いて、光誘導性にRaf活性を誘導出来るマウスを作成したが、実際に使用したところ、CRY2を始めとするフラビン酵素由来の光遺伝学ツールはニ光子励起効率が著しく低く、生体観察に使用には不十分なツールで有ることが判明した。
融合蛋白やリンカー等を改良することにより、ニ光子励起で活性化しやすい新規光遺伝学ツールの開発に成功した。これは現時点で報告のない新規のツールであり、本ツールの開発自体が大きな成果と考えられる。また、生体内のがん微小環境で分子シグナルを操作するツールとしても有用であり、当初の計画としても、おおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

FRETマウスに担癌・発癌実験を行い、がん細胞・間質細胞の局在、動態、ERK活性を観察
することにより、間質細胞の動態やERK活性と、がん細胞の形質の関連を調べる。また阻
害剤や各種shRNA用いた特定のシグナル阻害下でも同様の観察を行い、がん細胞と間質細
胞の相互作用を規定する分子機構を探索する。
また、間質細胞におけるERK活性化が、がん細胞の形質を変化させうるかを検証するため、平成29年度に作成したニ光子励起用の光遺伝学ツールを用いて、がん細胞または間質細胞においてERKシグナルを活性化させた際の、それぞれの細胞への影響や分子活性の変化を観察する。