2万種ヒトプロテインアレイを用いた化合物から標的タンパク質を同定する技術の開発

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17J08477
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 山中 聡士 愛媛大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2017-04-26 – 2020-03-31
• Keywords: サリドマイド / 低分子化合物 / コムギ無細胞系 / 網羅的スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

薬剤開発において、タンパク質に作用する化合物の特異性は重要であるが、化合物が想定外に反応するオフターゲットを予見することは不可能である。もし薬剤開発の初期段階において、化合物と想定外タンパク質の相互作用を評価することができれば、化合物の修飾展開などにより想定外タンパク質への相互作用を回避した特異性の高い化合物の開発が可能であると考えられる。また、新規標的タンパク質の同定により、別の疾患に対する治療薬としての利用及び研究が可能であると考えられる。しかしながら、これまで主流であった細胞抽出液を用いた評価系では、細胞間や細胞の状況に応じてタンパク質の種類や量に差異が生じていることや細胞内には様々なタンパク質が同時に発現していることなどから同定困難なタンパク質が存在していた。 本研究は、コムギ無細胞系によって合成された2万種のヒトプロテインアレイとモデル化合物サリドマイドを用いて化合物をベイトに相互作用するタンパク質を網羅的に同定できるインタラクトーム技術開発を研究目標にする。
本研究において、昨年度(平成29年度)は、初めにモデル化合物サリドマイド-タンパク質間の相互作用検出系に構築に向けたサリドマイド誘導体の有機合成を行った。そして、合成したサリドマイド誘導体を用いて、ハイスループットな相互作用検出系を構築した。その後、本研究室の保有する2万種ヒトプロテインアレイを対象に新規サリドマイド標的タンパク質の同定に向けた網羅的なスクリーニングを行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

AlphaScreen法を用いた相互作用の検出において、当初予定していたサリドマイド誘導体は、既知の標的タンパク質であるCRBNとの相互作用の検出が出来なかった。よって、新たな化学構造のサリドマイド誘導体の有機合成を行う必要があり、当初の計画より研究が遅れた。しかしながら、新たな構造のサリドマイドを用いて、相互作用の検出に成功した。そして、網羅的なスクリーニングに向けた評価系の構築し、2万種ヒトプロテインアレイを用いて網羅的なスクリーニングを行い、候補タンパク質を見出した。

Strategy for Future Research Activity

1. スクリーニングの上位約100種のタンパク質について、クローニングを行い、コムギ無細胞系を用いてタンパク質を合成する。
2. AlphaScreen法を用いて2次スクリーニングを行い、新規標的タンパク質の同定を目指す。
3. Pull-down法やAlphaScreen法を用いて、新規標的タンパク質における結合部位の同定を行う。
4. 細胞抽出液へサリドマイドを固定化したビーズを付加し、過剰発現させた新規標的タンパク質との相互作用を細胞内で確認する。
5. 組換えタンパク質及び細胞内において、サリドマイドが標的タンパク質に与える影響について評価を行う。