2018 Fiscal Year Annual Research Report
Ｅｐｈ受容体シグナル破綻によるグリオブラストーマ悪性化の分子機構の解明
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17J08982
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
濱岡 裕穂 京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | がん / Eph受容体 / 神経膠芽腫 / 細胞増殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チロシンキナーゼ受容体ファミリーに属するEph受容体は、そのリガンドであるephrinと結合し、下流へシグナルを流すことで、本来発生過程における胚形成、形態形成において重要な役割を果たしている。Eph受容体・ephrinシグナルが破綻することで、発がん・がんの悪性化が引き起こされることが明らかになっている。
Eph受容体の一つであるEphA2は、悪性度の高い脳腫瘍であるグリオブラストーマを含む様々ながんにおいて過剰発現しており、発現量と、がんの悪性度との間に相関関係があることが報告されている。これまでに、我々は、EGF刺激やEphA2の過剰発現によるEphA2のチロシンキナーゼ活性の上昇により、MEK/ERK/RSK経路が活性化され、EphA2の897番目のセリン (S897) がリン酸化されることにより、神経膠芽腫細胞の増殖が促進されることを明らかにした。しかしながら、EphA2のS897リン酸化の下流でどのような分子が働き、細胞増殖を促進させているのかは現在のところ明らかにされていない。そこで、今年度の研究では、EphA2に結合する分子に着目し、EphA2のS897リン酸化による細胞増殖の促進に関わる分子メカニズムについて検証した。神経膠芽腫細胞の溶解液をEphA2の抗体で免疫沈降を行い、EphA2と細胞内で結合しているタンパク質について質量分析法を用いた網羅的な解析を行った。同定されたタンパク質について、in vitroにおけるEphA2との結合性についても確認することができた。
さらに、今年度は、神経膠芽腫細胞において高発現が確認されているEphA3受容体に着目し、EphA3ノックアウト細胞及び過剰発現細胞をそれぞれ神経膠芽腫細胞で作成し、これらの細胞を用いてEphA3受容体の発現が、がん細胞の凝集体形成に及ぼす影響について解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、1) 神経膠芽腫においてEphA2と複合体を形成するタンパク質の網羅的解析、2) EphA3による神経膠芽腫細胞の凝集体形成制御の解析を行った。
1)については、EphA2と細胞内で結合しているタンパク質について網羅的な解析を行い、同定されたタンパク質について、in vitroにおけるEphA2との結合性についても確認しており、今後はその機能的意義について調べていく予定である。
2)については、EphA3ノックアウト細胞及び過剰発現細胞をそれぞれ神経膠芽腫細胞で作成し、浮遊培養条件下で形成される細胞の凝集体の大きさを比較した。その結果、EphA3ノックアウト細胞では神経膠芽腫細胞の浮遊培養条件下で形成される細胞の凝集体の大きさが有意に小さくなった一方、EphA3過剰発現細胞では凝集体の形成が促進された。がん細胞の凝集体の大きさは、がん細胞の増殖及び生存と相関関係があることが報告されている。また、浮遊培養条件下では神経膠芽腫の悪性化に大きく関わっているEGFによってEphA3の発現がタンパク質レベルで制御され、それにはEGFによるAktの活性化が必要であることも示唆された。さらには、EphA3がN-cadherinの発現上昇を促進することで、凝集体の形成を促進していることも見出された。以上の結果から、EphA3はEGF-Aktシグナル経路によってリガンド非依存的に制御され、浮遊培養条件下での神経膠芽腫細胞の凝集体形成促進に働いていることが示唆された。これらの内容について学術論文として発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度行った研究により、EphA2と細胞内で結合しているタンパク質を同定することができた。これまでに、EGF刺激により、MEK/ERK/RSK経路の下流でEphA2のS897がリン酸化されることにより、神経膠芽腫細胞の増殖が促進されることがわかっている。今後は、同定されたEphA2結合タンパク質がEphA2受容体シグナルによる神経膠芽腫細胞の増殖促進にどのように関わっているかについて検証を行う。
まず、結合タンパク質をsiRNAによりノックダウン、あるいはsgRNAを作成してノックアウト細胞を樹立し、EGF刺激を介した神経膠芽腫細胞の増殖促進、さらにはEphA2による神経膠芽腫細胞の増殖促進に与える影響を調べる。また、様々な変異体を用いて、EphA2と結合タンパク質との結合部位の同定を行い、両者の結合が神経膠芽腫細胞の増殖促進に与える影響を調べる。次に、EphA2のS897リン酸化との関係を明らかにするため、897番目のセリンをアラニンに置換したEphA2-S897A変異体を用いて、EphA2野生型と比較して、結合に変化が見られるか検討する。また、EphA2の発現を抑制した神経膠芽腫細胞を用いて、EphA2が高発現することによって発現が変化する遺伝子をマイクロアレイ解析により網羅的に解析を行い、得られた解析結果から遺伝子がEphA2受容体シグナルによるがん悪性化にどのように関わっているかについて、同様に、siRNAによるノックダウン、あるいはsgRNAを作成してノックアウト細胞を樹立することにより検討する。
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Research Products
(2 results)
