2018 Fiscal Year Annual Research Report
Ｎ６－メチルアデノシンのＲＮＡ配列選択的脱メチル化法の開発
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17J09621
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
神山 健太 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | RNA / エピジェネティクス / メチル化 / 脱メチル化 / タンパク質化学修飾 / タンパク質工学 / 配列選択性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度はN6-メチルアデノシン（m6A）の脱メチル化酵素であるALKBH5に対してDNAの修飾を行った。
m6Aは多くのmRNA上に見られる修飾であり、mRNAの局在や分解、翻訳量の制御などに関与すると言われている。近年ではm6AがmRNAの上流にあるか下流にあるかで果たす役割が異なることが示唆されている。しかし特定の位置のm6Aを制御する手法が無いために詳細な研究はなされていなかった。そこでm6Aの脱メチル化酵素ALKBH5に配列選択性を付与することで特定の位置のm6Aを選択的に脱メチル化できるのではないかと考えた。相補的なDNAとRNAが二本鎖を形成することに着目し、ALKBH5にDNAを結合させることで特定のRNA配列近傍のm6AのみをALKBH5によって脱メチル化しようと試みている。平成29年度では（1）DNAを結合させるため、及び、（2）非特異的なALKBH5の脱メチル化反応を抑制するためのALKBH5の改変を行った。平成30年度では改変したALKBH5に対してDNAを結合させた。
DNAを結合させるための手法として考えていたπ-Clamp法において必要なFCPFというタグ配列を組み込んだALKBH5に対して、FCPF配列中のシステイン残基と反応する化学構造を組み込んだDNAを合成し反応させた。ALKBH5とDNAは結合したものの、収率が低いため別の手法の検討を行うことにした。
反応効率の良い手法として、N末端にGGG配列をもつタンパク質とC末端にLPETG配列をもつタンパク質を結合させることのできるSortaseという酵素を用いた手法や、タンパク質と融合したHalo-tagタンパク質とその基質の結合を利用した手法がある。それらの手法において必要なALKBH5の標識を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究はRNA配列選択的にALKBH5の脱メチル化反応を引き起こすものである。そこで、如何にしてALKBH5にRNA配列選択性をもたせるかが重要である。ALKBH5に配列選択性をもたせるために、特定配列をもつRNAに対する結合能を上げ、一方で特定配列をもたないRNAに対する結合能を下げるアプローチを計画していた。具体的には、特定配列のRNAに相補的な配列のDNAをALKBH5に結合させることで特定配列のRNAへの結合能を上げ、またALKBH5自体のRNA結合能を減少させることで非特異的なRNAへの結合能を下げることができると考えた。平成30年度はDNAが結合でき、RNAへの結合能が落ちるように改変されたALKBH5に対してDNAを結合させることを予定していた。実際にALKBH5に対してDNAは結合させることができたため期待通りの進展と考えている。実際にDNAを結合させたALKBH5が期待通りに配列選択的なm6A修飾の脱メチル化を起こすか興味深い。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度ではALKBH5とDNAの結合体を収率良く作成することができず、結合体が配列選択的にm6Aを脱メチル化するのかアッセイすることができなかった。したがって次年度では別の手法でより効率的にALKBH5とDNAを結合させることで目的とする結合体の脱メチル化アッセイを行いたい。そのために平成30年度では、これまでとは別のALKBH5とDNAを結合させるための手法において必要なタグ配列をALKBH5に組み込んだ。ALKBH5と結合できるような化学修飾をDNAに施し、実際にDNAとALKBH5を結合させたい。そして得られたDNA-ALKBH5結合体が目的の挙動を示すか、つまりRNA配列選択的な脱メチル化を引き起こすかを調べたい。RNA配列選択的なm6Aの脱メチル化が確認できれば、本手法は初めての配列選択的なm6Aの制御手法となる。この手法を用いてm6A修飾の位置とRNAの機能の関係を解き明かしていきたい。
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