先天性代謝異常症を発症する疾患モデルブタの作出と利用に関する研究

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17J09699
• Research Institution: Meiji University
• Principal Investigator: 内倉 鮎子 明治大学, 明治大学大学院農学研究科博士後期課程, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2017-04-26 – 2019-03-31
• Keywords: オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症

Outline of Annual Research Achievements

本課題は、これまでに核移植法 (無性生殖的方法)により作成したオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症 (OTCD) モデルブタを有性生殖によって量産出来るシステムを構築することが、当面の目的であり、その生産システムを基盤として、OTCDブタを実際に用いたトランスレーショナルリサーチを遂行することが、最終的な目的である。
今年度は、OTC 遺伝子KO の形質を有するキメラ個体の作出に取り組んだ。我々はこれまでに、致死の形質を有する遺伝子改変ブタを正常個体の細胞とのキメラ状態にすることで、正常発育可能な状態に導き得ることを確認している。
OTC遺伝子の第2 exonに変異を持つブタ胎仔繊維芽細胞を受精卵核移植の核ドナー細胞とし、OTC-KOクローン胚（雄細胞由来）を作成した。同時に、正常な胎仔線維芽細胞を各ドナー細胞とした正常クローン胚（雌細胞由来）を作成した。OTC-KOクローン胚に正常クローン胚の割球を注入したキメラ胚盤胞を作製し（胚盤胞補完、Matsunari et al., 2013）、仮腹雌の子宮へ移植した結果、雄キメラ産仔を得た。OTCDキメラ産仔はOTCDの症状を一切示すことなく健康に成長した。キメラ個体の血液を採取し血算値と血液生化学値を調べた結果、全ての検査項目において正常範囲内であり、肝疾患がないことを確認した。 OTCキメラ個体を野生型メスと交配させ、妊娠を確認した。キメラ個体が繁殖能力を有することが示された。
先天性代謝異常症は、小児科領域で非常に重要な課題であり、OTCDを発症するモデルブタの開発と、それを用いたトランスレーショナルリサーチから得られた知見は極めて大きな意義を持つ。希少難病の救済やオーファンドラッグの開発に、ヒトの病態を忠実に再現するモデルブタが大きな役割を果たすと考えられるので、本研究から将来の新たな展開が大いに期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度、実施予定であった1. OTC遺伝子KOクローン胚と正常胚とのキメラブタの作出、2. キメラブタの正常性や成長の確認、3. キメラブタの生理学・生化学的データの収集 について遅滞なく取り組み、着実に研究成果を挙げた。X連鎖性遺伝病モデルブタの作出に関する共著論文 (Modeling lethal X-linked genetic disorders in pigs with ensured fertility. Proceedings of National Academy of Science USA, 115:708-713, 2018. )においても、習得した胚操作の知識と技術を生かして重要な役割を果たした。以上の理由より計画通りの順調な研究進捗と評価と判断した。

Strategy for Future Research Activity

キメラ個体の性成熟後は交配に用いて後代産仔を作出する。F1産仔の雌はOTCヘテロKOのキャリア個体となるので、これらをキメラブタあるいは野生型雄との交配に供してF2世代を得る。F2世代においては、OTCDを発症する雄個体とヘテロKO雌個体(キャリア)が、メンデリズムに従って得られることになる。さらにキメラ雄から精子を採取し、それを用いた体外受精や顕微授精の条件検討を行う。以上を通じて、OTCD発症個体(雄)およびOTCヘテロKO雌(キャリア雌)を、量産出来るシステムを構築する。
雄のOTCD個体を用いて、男児患者に用いられる栄養療法や薬物療法などの対処療法を施し症状改善に有効な処置を確定する。一方、肝細胞移植、人工肝組織(肝芽)などの、試験的移植に供する。OTCヘテロKOの雌個体については、女児におけるOTCD発症の機構解析に供する。OTCヘテロKO雌における、X染色体不活性化と病態発現の相関や、その他発症に関する因子の解明に取り組む。

Research Products

• [Journal Article] Modeling lethal X-linked genetic disorders in pigs with ensured fertility (2018)
  • Author(s): Matsunari Hitomi、Watanabe Masahito、Nakano Kazuaki、Enosawa Shin、Umeyama Kazuhiro、Uchikura Ayuko、Yashima Sayaka、Fukuda Toru、Klymiuk Nikolai、Kurome Mayuko、Kessler Barbara、Wuensch Annegret、Zakhartchenko Valeri、Wolf Eckhard、Hanazono Yutaka、Nagaya Masaki、Umezawa Akihiro、Nakauchi Hiromitsu、Nagashima Hiroshi
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 115 Pages: 708～713
  • DOI: 10.1073/pnas.1715940115
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 中空糸ガラス化（HFV）法によるマウス未受精卵凍結保存の研究 (2018)
  • Author(s): 後藤千夏, 笠井悠里, 陳聰聰, 林明日香, 内倉鮎子, 松成ひとみ, 長嶋比呂志
  • Organizer: 日本畜産学会第124回大会
• [Presentation] 中空糸法によるブタ胚および割球のガラス化保存 (2017)
  • Author(s): 内倉鮎子, 八島紗耶香, 梅木育磨, 板崎栞, 中野和明, 松成ひとみ, 長嶋比呂志
  • Organizer: 第３５回日本受精着床学会 総会・学術講演会
• [Presentation] TALENおよびCRISPR-Cas9を用いたブタ卵へのCytoplasmic injectionによるモザイクの出現頻度 (2017)
  • Author(s): 渡邊將人, 内倉鮎子, 八島紗耶香, 松成ひとみ, 中野和明, 高柳就子, 梅山一大, 佐久間哲史, 山本卓, 森田純代, 堀居拓郎, 畑田出穂, 長嶋比呂志
  • Organizer: 日本ゲノム編集学会第2回大会
• [Presentation] 膵島・血管同時欠損ブタおよび肝臓欠損ブタの胚盤胞補完 (2017)
  • Author(s): 松成ひとみ, 渡邊將人, 内倉鮎子, 八島紗耶香, 岡本一駿, 武藤智之, 徳山雄紀, 中野和明, 梅山一大, 長屋昌樹, 中内啓光, 長嶋比呂志
  • Organizer: 第17回日本再生医療学会
• [Presentation] Generation of SALL1 knockout pigs using the CRISPR/Cas9 system via cytoplasmic injection (2017)
  • Author(s): Watanabe M, Uchikura A, Morita S, Matsunari H, Takayanagi S, Yashima S, Nakano K, Umeyama K, Horii T, Hatada I, Nagashima H
  • Organizer: Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Generation of SALL1 KO pigs by cytoplasmic injection of Platinum TALEN mRNA into zygotes (2017)
  • Author(s): Yashima S, Watanabe M, Uchikura A, Nakano K, Matsunari H, Kasai Y, Fukuda T, Takayanagi S, Umeyama K, Sakuma T, Yamamoto T, Nagashima H
  • Organizer: Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Phenotypic variation in the cloned pigs with heterozygous fibrillin-1 mutation (2017)
  • Author(s): Umeyama K, Arai Y, Nakano K, Fukuda T, Umeki I, Uchikura A, Kasai Y, Matsunari H, Nagaya M, Watanabe M, Ohgane J, Nagashima H
  • Organizer: Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Post-mortem sperm regeneration from genetically modified disease model pigs (2017)
  • Author(s): Kasai Y, Umeyama K, Katsumata Y, Yashima S, Uchikura A, Matsunari H, Nakano K, Nagashima H
  • Organizer: Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Induced chimerism rescues lethal trait of Duchenne muscular dystrophy (DMD) model pig (2017)
  • Author(s): Matsunari H, Kurome M, Yashima S, Fukuda T, Nakano K, Uchikura A, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Kessler B, Wuensch A, Klymiuk N, Wolf E, Nagashima H
  • Organizer: Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of vitrified blastomeres of genotyped porcine embryos (2017)
  • Author(s): Uchikura A, Yashima S, Umeki I, Matsunari H, Nakano K, Itazaki S, Nagashima H
  • Organizer: Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017)
  • Int'l Joint Research