2017 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis of intracellular signal transduction by b2 adrenergic receptor
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17J11420
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
夏目 芽依 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | GPCR / アレスチン / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Gタンパク質共役型受容体 (GPCR) のアレスチンを介したシグナル伝達経路では、GPCRのC末端がGPCRキナーゼ (GRK) によってリン酸化されることで、アレスチンが結合する。リン酸化がアレスチン結合に重要であることは示されているものの、アレスチンがリン酸化状態のGPCRをどのように認識するか不明であった。本研究では、GPCRの一種である β2アドレナリン受容体 (β2AR) について、アレスチン結合状態の構造をNMR法にて解析した。
メチオニン側鎖メチル基を13C標識した β2ARを、再構成高密度リポタンパク質の脂質二重膜に再構成した (β2AR-rHDL)。調製した β2AR-rHDLをGRK2によりリン酸化して、完全アゴニスト存在下におけるリン酸化状態の受容体を調製した。そのサンプルに対して、精製したアレスチンを添加して1H-13C HMQCスペクトルを取得した。
アレスチン結合状態では5残基全てに対応するシグナルを観測した。一方、これまでに取得したリン酸化状態の1H-13C HMQCスペクトルでは、観測対象のメチオニン5残基中4残基を観測していた。リン酸化前のスペクトルと比較すると、細胞内側に位置するM215のシグナルは、リン酸化状態、アレスチン結合状態の順に1H方向低磁場側へシフトしていた。結晶構造から、膜貫通へリックス6 (TM6) のF282と近接するM215の化学シフト値は、TM6の構造変化を反映すると考えることができる。今回の結果は、リン酸化に伴い、TM6の細胞内側がアレスチン結合に有利な構造に変化することを示唆する。本研究成果から、アレスチンは、C末端に加えて、リン酸化に伴い構造変化した膜貫通領域を認識することで、多様なGPCRとリン酸化依存的に結合する、というモデルを提唱する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、平成29年度はアレスチン結合状態の受容体の構造情報を得ることを目標としていた。実際にGPCRのアレスチン結合状態の構造解析を進めることができたため、進捗状況はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画の変更、あるいは研究を遂行する上での問題点はない。
当初の計画通り、2年目である平成30年度は、Gタンパク質結合状態の受容体の構造情報を取得することを目標とする。そのためにまずは、三量体Gタンパク質の昆虫細胞発現系を新たに構築する。Gタンパク質のコンストラクトは、脂質修飾を欠損したものと野生型のものの2種類を構築する。これらのうち、発現量、精製法ともにNMR解析に十分なものを検討する。受容体との混合サンプルについてゲル濾過解析等を用いて相互作用解析を行い、結合する実験条件を探索する。その後、β2ARとの結合を確認したサンプルについてNMR解析を行う。Gタンパク質結合状態の結果を、アレスチン結合状態のスペクトルと比較して詳細な解析を行う。
そして、3年目である平成31年度は、GRK結合状態の受容体の構造所法を取得することを目標とする。そのためにまず、GRKと受容体が安定な複合体を形成する条件を探索する。結合するGRKのサブタイプを検討する。また複合体を得る手段として、ATPアナログであるAMPPNPを添加して受容体とGRKを混合する、あるいは受容体に対してGRKを過剰量添加する、あるいはGRKを受容体のC末端に付加したコンストラクトを構築する等の方法を考えている。それぞれについて、ゲル濾過解析等により相互作用解析を行い、GRKと受容体が結合する条件を探索する。いずれかの方法で複合体の形成が確認されれば、同条件のサンプルについて1H-13C HMQCスペクトルを取得する。得られたスペクトル結果をアレスチン結合状態、ならびにGタンパク質結合状態のスペクトルと比較して詳細な解析を行う。
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