2019 Fiscal Year Annual Research Report
睡眠・覚醒時の大脳皮質神経ネットワークの活動様態の解明
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17J40129
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
大山 薫 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 特別研究員(RPD) (30713044)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2023-03-31
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| Keywords | 光遺伝学 / 細胞外記録 / マウス / 睡眠 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳幹のレム促進ニューロンの神経発火活動と睡眠の関係を調べるために、オプトロードの開発を行った。オプトロードは、光遺伝学と細胞外記録を同時に行うことで特定の神経細胞の活動をミリ秒単位で制御することができる技術である。
光感受性のタンパク分子オプシン；channelrhodopsin 2 (ChR2)をAAVウイルスベクターを用いて神経細胞膜表面に発現させる。ChR2に感受性のある青色光を照射するとChR2の構造変化が起こり活性化し、光照射と同時に細胞内へのイオンの流出入が起こる。
細胞外記録法は、微小電極を脳内に慢性的に埋め込み神経細胞にマイクロ単位で電極を近づけることで細胞外の微小な電位変化を検出する方法である。行動動物における神経細胞の活動電位を調べることができる。
本研究ではChR2を全脳の興奮性細胞に発現するVglut2;Ai32マウス（Vglut2-Cre; Rosa6-CAG-LoxP-stop-loxP-ChR2-eYFP）を作成した。また光照射と同じ部位から神経細胞外電位を記録するためのオプトロードの設計を行った。Vglut2；Ai32マウスの脳幹にオプトロードを埋め込んだ。また同時に、睡眠判定を行うための脳波測定用ネジ電極、筋電図記録用のワイヤを左右首筋に取り付けた。
１週間の回復期間ののち、マウスを記録装置（Neuralynx）に繋ぎ、光照射と電気活動の記録を行った。光の強さを6mW, 12.5mW, 25mW（5Hz, duration=5ms）を段階を変えて照射し、睡眠時のマウスの行動の変化および電気活動に変化がみられるかどうかを確かめた。6mWの光強度では行動、電気活動共に変化は見られなかった。12.5mWでは、マウスは起きることはなかったが細胞外電位では光刺激により誘発された電位変化が見られた。25mWの光刺激を行うとマウスは目を覚まし、電位変化も見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
深部・小さい脳部位に同時に光照射と細胞外電位を記録するためのオプトロードの設計・および手術が成功したことが主な理由です。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回は２匹のVglut2;Ai32マウスにオプトロードの埋め込み手術を行い、記録実験を行うことができた。いずれもマウスでも、手術時のミスにより微小電極を上下に動かすためのマイクロスクリューを動かすことができなかったので、スパイク（活動電位）を観察することができなかった。今後は細かなオプトロードの設計の改良と手術数を増やしてオプトロードの作成および手術に慣れ、ミスを減らすことでスパイクの検出の成功を目指す。最終的には、光感受性細胞の活動電位を検出することを目指す。
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