2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K00548
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
茂木 章 京都大学, 医学研究科, 助教 (80452332)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | DNA損傷トレランス / 複製後修復 / 相同組換え / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
■ A-1. SHPRH/BRCA1二重変異DT40株の解析: SHPRH/BRCA1二重変異株の主要DNA修復経路の機能状況を知るために、各経路の機能を反映する代表的DNA損傷剤に対する感受性のプロファイリングを行った。その結果、SHPRH/BRCA1二重変異株はオラパリブ (PARP阻害剤)とカンプトテシン(topoisomerase I阻害剤)に高感受性を示し、γ線(DSB修復を反映)、エトポシド (topoisomerase II阻害剤)、シスプラチン(DNA架橋損傷剤)に対する感受性はBRCA1単独変異株と変わらなかった。これらのことから、SHPRH/BRCA1二重変異株は、鎖切断に起因する相同組換え修復HDR経路と相補的に働く修復経路に機能不全があることが示唆された。SHPRH/BRCA1二重変異株の標的組換え効率は、BRCA1単独変異株に比較して大幅な回復が見られた。また、SC-neo遺伝子座における相同組換え効率はBRCA1単独変異株に比べてSHPRH/BRCA1株では回復が見られた。これらのことからSHPRHは相同組換えにおいてBRCA1と拮抗的に働くことが示唆された。また、SHPRH/BRCA1二重変異株にSHPRH遺伝子を再導入した細胞株を作成した。
■ A-2. ZRANB3単独変異株の感受性プロファイリングを行なった。また、ZRANB3/BRCA1二重変異株及びSC-neo遺伝子座を導入したZRANB3/BRCA1株を作成した。
■ B. ヒトBRCA1変異乳がん細胞株UWB1.289とBRCA1遺伝子を相補した細胞株にSHPRHのshRNAを発現させた細胞株を作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
■ A-1. SHPRH/BRCA1二重変異株の各種DNA損傷に対する感受性のプロファイリングを行った。標的組換え効率、相同組換え効率の測定、PARP阻害剤処理後の細胞周期解析などを行った。また、SHPRH/BRCA1二重変異株にSHPRH遺伝子を再導入した細胞株を作成し、PARP阻害剤に対する感受性が回復することを確認した。Flp-In部位を導入したSHPRH変異株にさらにtetracycline repressor (TetR)を導入した細胞株を作成した。DNA新生鎖を蛍光標識で検出するDNA fiber assayは、条件検討を行なった。
■ A-2. SC-neo遺伝子座を導入したZRANB3/BRCA1二重変異DT40株を作成した。
■ B. ヒトBRCA1変異乳がん細胞株UWB1.289とBRCA1遺伝子を相補した細胞株にSHPRHのshRNAを発現させた細胞株を作成した。CRISPR/Cas9によるSHPRH, HLTF遺伝子破壊系の評価を行なった。
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| Strategy for Future Research Activity |
■ A-1. SHPRH/BRCA1二重変異細胞のPARP阻害剤添加後のRAD51とγH2AXの集積、染色体断裂率、相同組換え効率の測定などをSHPRH遺伝子を再導入した細胞を加えて追加検討する。 SHPRH, BRCA1単独変異株、SHPRH/BRCA1二重変異株、SHPRH/BRCA1二重変異株にSHPRHを遺伝子相補した細胞株を用いて、DNA新生鎖を蛍光標識抗体で検出するDNA fiber assayを行う。
■ A-2. これまでに作成したZRANB3/BRCA1二重変異株のオラパリブ、カンプトテシン及びγ線に対する感受性を検討する。
■ B. ヒトBRCA1変異乳がん細胞株UWB1.289においてSHPRH遺伝子の発現抑制をした細胞株の表現型解析を行う。また、CRISPR/Cas9を用いてヒトSHPRHおよびBRCA1遺伝子の単独変異株を作成する。これらの細胞株が出来次第、各細胞株を用いてDT40細胞の解析に準じた表現型解析を行う。
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| Causes of Carryover |
本研究に関連する総説執筆のため、A-1. SHPRH/BRCA1二重変異株の染色体断裂率の測定、DNA fiber assay、A-2. ZRANB3/BRCA1二重変異株の表現型解析、B. ヒトBRCA1変異細胞のCRISPR/Cas9によるSHPRH遺伝子破壊実験などの実施にやや遅れが生じたため、これらにかかる研究費の執行を次年度に繰り越した。次年度にこれらの予算を執行し、実験を実施する予定である。
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