2021 Fiscal Year Annual Research Report
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17K00548
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
茂木 章 京都大学, 医学研究科, 助教 (80452332)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | DNA損傷トレランス / 複製後修復 / 相同組換え / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
■ A-1.相同組換え修復(HR)と複製複製後修復(PRR)は、複製停止の解除において独立した機能を持つと推測される。HRとPRRの機能相関を明らかにするために、HRの中心制御因子であるBRCA1遺伝子のエクソン11を薬剤マーカーで置換したBRCA1-/-株とエクソン11によってコードされる1,118アミノ酸を欠くBRCA1Δ11/Δ11株を作成した。これらの株は同程度のγ線感受性を示すのに、BRCA1 -/-株はBRCA1Δ11/Δ11株に比べてより強いシスプラチン感受性を示した。このことからDNA二本鎖切断修復にはBRCA1のエクソン11が必須だが、相同組換え修復(HR)においてはエクソン11とエクソン11以外の部分(BRCA1Δ11)双方の貢献が必要であることが示唆された。また、PRRの中心制御因子であるRAD18/SHPRHとBRCA1-/-の三重変異株を作成し、この株はBRCA1-/-単独変異株より強いシスプラチン感受性を示した。このことからPRRとHRはシスプラチンによる複製阻害からの回復において独立した働きを持つことが示唆された。
BRCA1Δ11/Δ11株のOVA遺伝子座へのSC-neo遺伝子ノックイン効率は41.4% (12/29)に比べてSHPRH-/- BRCA1Δ11/Δ11二重変異株の効率は78.1% (25/32)と回復した。一方、BRCA1-/-単独変異株の効率は13.5% (5/37)であるのに対してSHPRH-/- BRCA1-/-株の効率は3.2% (2/30, 0/32)と大幅に低下した。SC-neoアッセイによる相同組換え(HR)効率は、SC-neoノックイン効率にほぼ比例した。これらのことから、SHPRHはBRCA1が不在の時(BRCA1-/- background)に相補的な働きをすることが示唆された。
■ A-2. ZRANB3-/- BRCA1-/-二重変異株の感受性プロファイリングを行なった結果、γ線、シスプラチンに対してBRCA1-/-変異株とほぼ同等の感受性を示した。
■ B. CRISPR/Cas9の変法であるPrime Editor法を用いてZRANB3のヌクレアーゼ活性中心変異のZRANB3-T66RのヒトRPE細胞株を作成した。
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