2019 Fiscal Year Research-status Report
新規グアニン酸化損傷は突然変異源として、８オキソグアニンと同じ重要性を有するか？
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17K00558
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
喜納 克仁 徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (70360534)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | グアニン酸化損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酸化条件において、G→T点突然変異やG→C点突然変異が観測されているが、グアニン酸化損傷である8オキソグアニンではG→C点突然変異を説明できない。申請者はオキサゾロンがG→C 点突然変異を説明できるグアニン酸化損傷であると報告したが、オキサゾロンは徐々に分解することが最近明らかとなった。 そこで本研究では、申請者が発見した新規グアニン酸化損傷Xについて、構造決定および突然変異能、修復反応を調べる。本研究により、X が8オキソグアニンに匹敵する突然変異源になり得るかの可能性を探ることを目的とする。
平成29年度の大腸菌由来のポリメラーゼに加えて、平成30年度においては、Oz分解生成物Xを含む30merDNAの追合成とDNAポリメラーゼαやβ、δ、ε、ζ、ηについても実施した(一部学会未発表)。令和元年度は、RI施設廃止に伴い、蛍光色素ラベルした基質でも修復酵素の活性を解析できるか否かについて再検討することとなった。そこで、Alexa680をラベルした8oxoG入りオリゴマーを受託合成依頼し、これを用いて大腸菌由来の塩基除去修復酵素について活性測定を解析したところ、切断活性が実験ごとに異なるという大変困った現象がおきた。原因を追求していくと、どうやら反応停止剤が機能せず、色素ラベルでの解析についてはより検討を要することとなった。令和元年度は、TXの調製よりもより解析できることが増える、Xのde novo合成を開始した。最後に、ピペリジン処理や熱による不安定性についても解析した結果、非常に安定であることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究代表者の実母が3年8ヶ月前に脳腫瘍を患い、入院や介護の付き添いで、研究と教育に100%集中できな かったこともあり、全体的な計画の遂行が遅れたことと、解析のために必要となるHPLCが故障で研究遂行が遅れたこと、色素ラベル体を用いた修復反応活性の解析において、反応停止剤が機能せず、解析結果が不安定なものとなり、その根本的理由が判明していないこと、大学院生進学者候補が突如いなくなったことにより、マンパワーが不足し、Xのde novo合成が計画どおりに進捗していないことによるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
色素ラベル体を用いた修復反応活性の解析において、反応停止剤が機能せず、解析結果が不安定なものとなり、その根本的理由を明らかにして、なんとか修復反応についての解析を終了させたい。
また、DNAポリメラーゼδ、ε、ζ、ηを用いた結果も含め、塩基取り込み反応解析については、論文として発表する。ただし、Xのde novo合成との結果とを照らし合わせながら、発表の時期は令和２年度にするかどうか、シビアに検討する。
TXの調製よりもより解析できることが増える、Xのde novo合成を実施し、熱安定性や構造解析につながる量を得たい。
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| Causes of Carryover |
研究代表者の実母が3年8ヶ月前に脳腫瘍を患い、入院や介護の付き添いで、研究と教育に100%集中できなかったこともあり、全体的な計画の遂行が遅れたことと、解析のために必要となるHPLCが故障で研究遂行が遅れたこと、また、大学から支給される研究費でまかなったことにより、科研費から支出しなくてよくなったことが理由である。令和２年度は、非常勤職員を引き続き雇い、そのための人件費、かつ、今後の研究の推進方策に記載した実験の消耗品などで、それなりに支出する予定ではある。
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