2018 Fiscal Year Research-status Report

新規修飾型D-ドーパクロムトートメラーゼ関与による傷害肝内ネットワークの解明

Research Project

Project/Area Number	17K00568
Research Institution	Shimane University
Principal Investigator	日吉峰麗島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 助教 (30363162)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	D-ドーパクロムトートメラーゼ / 四塩化炭素 / 肝傷害 / プロテオミクス
Outline of Annual Research Achievements	本年度は、ラット正常肝および傷害肝それぞれから精製した未修飾型D-ドーパクロムトートメラーゼ (DDT) および修飾型DDTを培養細胞に添加した後の、リン酸化タンパク質の解析に着手してきた。解析条件の検討を進める中で、培養細胞へのDDT添加後のリン酸化タンパク質の増加レベルを、抗チロシンリン酸化抗体を用いたイムノブロッティングから評価を進めてきた。現在、安定したリン酸化タンパク質の増加を再現できる条件の決定にまで至っていないが、低い確率ではあるものの、DDT添加によるリン酸化タンパク質の増加を示す結果を獲得している。再現性の低さがイムノブロッティングによる検出条件の不安定さに原因があるのか、DDT添加条件の不安定さに原因があるのかを判断するため、DDTとは別に培養細胞へとインスリンを添加した後のリン酸化タンパク質の増加をイムノブロッティングにより評価したところ、再現性良くリン酸化タンパク質の増加が確認できたことから、イムノブロッティングの条件は適正であるものと判断した。そこで、DDT添加条件のさらなる検討が必要となることが明らかとなった。また、四塩化炭素を用いて培養細胞への傷害を誘導したところ、DDTの大部分が修飾型へと移行したこと、および細胞に含まれるタンパク質の多くに脱リン酸化が起こることを新たに明らかにした。精製DDTの添加によるリン酸化タンパク質の解析に、内在性DDTが解析の妨げになっている可能性をふまえ、次年度につなげる予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 精製DDTの添加によるリン酸化タンパク質の増加を、高い再現性で獲得できる条件の決定に至らなかったから。
Strategy for Future Research Activity	これまで培養細胞に精製DDTの添加を行った後、リン酸化タンパク質の解析を実施してきた中で十分な再現性が獲得できていない理由として、培養細胞自身がもつDDTが解析の妨げとなっている可能性がある。そこで、RNA干渉法により培養細胞に含まれるDDTの発現を抑制した細胞に、精製DDTの添加を実施してリン酸化タンパク質の解析を行う。またDDTの発現を抑制した細胞に肝毒素によって傷害を誘導し、添加した修飾型DDTと未修飾型DDTが傷害からの保護作用を有するか、細胞生存率の評価に使用されるMTT アッセイにより明らかにする。
Causes of Carryover	前年度に取り組んでいた仕事が十分に問題を解決するところまで至らず、当初計画していた実験の一部を遂行するに至らなかった。次年度は問題解決を目指してRNA干渉法を取り入れて実験を進める。また、論文作成のための校閲にも使用する予定である。