2018 Fiscal Year Research-status Report
Action mechanism of the insulin-inducible transcription factor and control of their gene expressions by diets and disease
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17K00891
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| Research Institution | Matsumoto University |
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Principal Investigator |
山田 一哉 松本大学, 大学院 健康科学研究科, 教授 (20263238)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | SHARP-2 / 時計遺伝子 / 転写因子 / インスリン / 膵β細胞 / Sox6 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私どもは、ラット肝において、高炭水化物食摂食後に誘導される転写因子として、basic helix-loop-helix 型転写抑制因子であり、24時間を刻む時計遺伝子でもある SHARP-2 を同定した。SHARP-2は、同様の構造を有する SHARP-1 とともに、SHARP family を形成している。ラット肝やラット高分化型肝癌細胞株である H4IIE 細胞において、SHARP family 遺伝子の発現はインスリンにより誘導され、標的である糖新生系酵素の phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) 遺伝子のプロモーター活性を低下させることから、SHARP family はインスリンによる血糖低下に関わる転写因子の一つであると考えている。また、脂肪細胞から分泌されるアディポネクチンや経口糖尿病治療薬であるメトフォルミンは、肝の5’-AMP-activated protein kinase (AMPK) を活性化し、PEPCK 遺伝子の転写を抑制する。AMPK の活性化剤である 5-aminoimidazole-carboxamide-1-β-riboside (AICAR) で H4IIE 細胞を処理すると、インスリンと同様、早期に一過性に SHARP-2 mRNA の発現が誘導されることも明らかにした。加えて、多くの転写因子が他のタンパク質と相互作用することから、yeast two-hybrid system により、ラット肝 cDNA ライブラリーから SHARP-2 と相互作用するタンパク質をスクリーニングしたところ、Sex-determining region Y-box 6 (Sox6) がクローニングされた。
本研究では、インスリン産生細胞である膵β細胞において、培養グルコース濃度の上昇に依存して、SHARP family 遺伝子の発現が調節されるかどうか、SHARP-2 と Sox6 のそれぞれの最小相互作用ドメインの解析、ならびに、SHARP-2 と Sox6 の相互作用がインスリン遺伝子の転写にどのように寄与するかについて検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膵β細胞株であるmouse insulinoma 6β (MIN6β) 細胞の培養液中のグルコース濃度を 5 mM から 25 mM へと上昇させたところ、24時間で、SHARP-2 遺伝子の発現が誘導されることが明らかになった。また、興味深いことに、同様に24時間で、インスリン遺伝子の発現も誘導されることが明らかになった。
次に、yeast two-hybrid system を用いて SHARP-2 と Sox6 の物理的相互作用について検討を行った。Sox6 の 144-787 番目までのアミノ酸配列を含むクローンである SL-88 との相互作用には SHARP-2 の 384-397 番目のアミノ酸配列が必要であることが明らかになった。逆に、SHARP-2 との相互作用に必要な SL-88 の最小ドメインは 201-362 番目のグルタミンに富むアミノ酸配列であることが明らかになった。
ラットインスリン遺伝子のプロモーター活性に対する SHARP-2 と Sox6 の機能的相互作用を検討するために、インスリン遺伝子のプロモーター領域を含むルシフェラーゼレポータープラスミドと SHARP-2 や Sox6 の発現ベクターをMIN6β細胞にコトランスフェクションした。その結果、SHARP-2 および Sox6 は単独でインスリン遺伝子の転写を上昇させることが明らかになった。さらに、SHARP-2 と Sox6 を 同時に発現させた場合、転写活性は相乗的に上昇することが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ラットインスリン遺伝子のプロモーター内の SHARP-2 応答性配列や Sox6 応答性配列を同定する。
SHARP-2 遺伝子のプロモーター領域を含むルシフェラーゼレポータープラスミドをMIN6β細胞にトランスフェクションし、グルコースに応答するDNA 配列を決定する。
SHARP-2 遺伝子のグルコース応答性配列の結合タンパク質をゲルシフト法や ChIP アッセイにより解析する。また、同定された転写因子の発現ベクターを構築し、実際にその配列に依存して転写が調節されるかどうかを検討する。
各種の食餌を摂食させた正常マウスおよび糖尿病マウスの各組織での SHARPs 遺伝子の発現状況解析を一定の月齢の中での経時的変化あるいは幼若・老齢などの月齢による側面から詳細に行う。
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