2017 Fiscal Year Research-status Report
小麦依存性運動誘発アナフィラキシーの原因遺伝子解析とそれに対応する小麦品種の探索
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17K00938
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
矢上 晶子 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (90367699)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 政志 藤田保健衛生大学, 付置研究所, その他 (30449467)
野口 恵美子 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40344882)
池田 達哉 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 西日本農業研究センター, 上級研究員 (60355138)
下條 尚志 藤田保健衛生大学, 付置研究所, 研究員 (70410751)
松永 佳世子 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (80131192)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 小麦依存性運動誘発アナフィラキシー / 発症予測マーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小麦依存性運動誘発アナフィラキシー(WDEIA)は小麦含有食品摂取後に運動等によりアナフィラキシーショッ クなど生命の危険にさらされることがあり、治癒が難しく、患者らは長期的に食生活に注意を払わなければなら ない。本研究では発症予測マーカーを探索し、患者らが摂取可能な小麦種を探索することを目的とする。申請者 らは既に全ゲノム関連解析により世界初となる加水分解小麦アレルギー疾患感受性遺伝子の同定に成功しており 、WDEIA についても同様に全ゲノム関連解析により疾患感受性遺伝子を同定することが可能であると考える。疾 患感受性遺伝子が同定された場合には、遺伝子型による発症リスク予測法の開発を行う。さらに、HLA に特徴が あった場合には、HLA と小麦遺伝子の結合性をコンピューターシミュレーションにより解析し、WDEIA 患者でも 摂取可能な(発症前であれば発症予防に繋がる)小麦種の開発基盤を作る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
WDEIA 患者サンプルの収集 藤田保健衛生大学坂文種報徳会病院、及び共同研究者の施設で診療中のWDEIA 患者 で本研究への参加に同意の得られた患者から血液サンプルを収集する。遺伝子型決定(SNP マイクロアレイ解析 )アフィメトリクス社のAxiom Precision Medicine Research Array を使用する。同意が得られた患者末梢血か らDNA を抽出し200ng のDNAを用いて増幅し、25~125 塩基対(bp)の断片にランダムに断片化を行う。これらの 断片を精製後、Axiom Precision Medicine Research Array にハイブリダイズさせる。Array を洗浄し、アレイ 表面で行われるマルチカラーのライゲーション反応後アレイを染色し、GeneTitan MC Instrumentにより画像を 取得する。取得された画像を用いてAxiom Analyisis Suite 2.0により遺伝子型を決定する。インピュテーショ ン法による非タイピング遺伝子多型の遺伝子型推定 各個人でタイピングされた80 万SNP のジェノタイプデータ を用いて数千万SNP のジェノタイプデータを推測することにより、網羅的なゲノム解析を実施する。全ゲノム関 連解析データに対して一般的なクオリティーチェックを実施。SNP インピュテーション参照データとして1000 ゲノムプロジェクトPhase 3 データを使用し、インピュテーションソフトウェアであるMinimacを使用する。イ ンピュテーション実施時に得られるimputation score に基づきSNP のQC を実施。ウェスタンブロット解析によ る小麦アレルゲン分子種の同定と低アレルゲン小麦の選定 既存の各種小麦とWDEIA およびGP19S による小麦ア レルギー患者の血清を使用してウェスタンブロット法による反応性の差異を検討する。
現在、確定診断患者からのサンプルを集め、解析に向け進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)遺伝子型決定(SNP マイクロアレイ解析)と関連解析
平成29年に引き続き遺伝子型決定を行い、全てのサンプルについて平成30年度内に遺伝子型決定を完了する。 得られた遺伝子型情報を用いてPLINK(https://www.cog-genomics.org/plink2)によるGWAS を実施する。GWAS で関連が認められたSNP については、独立した小麦アレルギーサンプルを使用して追認を行う。アレルギー疾患 への強い関与が報告されている主要組織適合遺伝子複合体(MHC)内のHLA 遺伝子については、HLA imputation 法を用いたHLA 遺伝子アレルおよびアミノ酸多型の推定を行う。参照データとしてNBDC ヒトデータベースに登 録された日本人健常者908名のデータおよび申請者が独自に保有する471 名のデータを用いることにより、主要 なクラスI HLA
遺伝子(HLA-A/B/C)、クラスII HLA 遺伝子(HLA-DRB1/DQA1/DQB1/DPA1/DPB1)の全てを対象としたHLA imputa tion 法の実施が可能になる。Imputation ソフトウェアとしてはSNP2HLA を使用する。強い関連が認められたHL A アレルについては、実測によるHLA 遺伝子型解析を使用する。上記検討結果により、発症リスク予測マーカー を確定する。
2)低アレルゲン小麦の特徴の特定
ゲノム解析で疾患とHLA 領域との関連が同定された場合には、既に報告されているω-5 グリアジンのエピトー プと、タンパク構造データベースに登録済のHLA の立体構造とのシュミレーションによる解析を行う。さらに、 ウェスタンブロットで反応性の低かった小麦品種のω-5グリアジンのアミノ酸配列情報を比較し、シュミレーシ ョンの妥当性を検証する。その後、上記検討で見つかった個々のタンパク質についても、同様にシュミレーショ ンし、どのタイプのWDEIA 患者が、どのタイプの小麦を摂取可能か特定する。最終的には、よりアレルゲン性が 低い小麦品種の開発のため、アレルゲン変異を集積させた系統の開発に着手する。
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| Causes of Carryover |
患者サンプルの収集が困難であった為研究が遅れているが、今後しっかりと進めていきたい。
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