2018 Fiscal Year Research-status Report
ケミカルダイレクトリプログラミングによるヒト網膜色素上皮細胞の直接誘導法の開発
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17K01365
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
倉橋 敏裕 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00596570)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 再生医学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
世界初のiPS細胞の臨床応用は加齢黄斑変性の治療に適用された。一方で、ES/iPS 細胞を用いた臨床応用では、残存する多能性幹細胞の混入や遺伝子導入による予期せぬ腫瘍化リスク、時間・コストを要するといった問題点の克服が必要とされている。そうした問題点を克服する手法として、ある種の体細胞から他の種類の体細胞を、多能性幹細胞を経ることなく直接誘導する手法（ダイレクトリプログラミング法）が近年注目されおり、これまでにいくつかの細胞種に関して報告されてきた。しかし、それらはいずれも遺伝子導入を伴うもので、移植後の腫瘍化リスクの問題点などが依然のこる。
そこで所属研究室では、そうした遺伝子導入を用いた既存のダイレクトリプログラミング法の問題点も克服する目的で、遺伝子導入を用いずに低分子化合物を用いたダイレクトリプログラミング法（ケミカルダイレクトリプログラミング法）の開発に取り組み、ヒト線維芽細胞を神経様細胞（Dai et al, JCBN, 2015）や褐色脂肪細胞（Takeda et al, Sci Rep, 2018）へ直接誘導する手法の開発に成功した。
本研究では上記ケミカルダイレクトリプログラミング法を改変・発展させ、社会的要求度、臨床応用への技術的基盤が整っている点に着目し、網膜色素上皮(RPE)細胞を低分子化合物で直接誘導する手法の開発を目指す。これまでに、神経様細胞直接誘導の場合と同様に線維芽細胞特異的な遺伝子発現を減少させ、形態的に上皮様細胞へ誘導する低分子化合物の組み合わせを見出した。しかしながらRPE細胞特異的な遺伝子発現を誘導する手法の開発には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度において、直接誘導法の開発を効率的に行うことを目的として、網膜色素上皮（RPE）細胞に特異的に発現しているRPE細胞マーカー遺伝子Aのプロモーター領域を緑色蛍光タンパク質（GFP）の上流に挿入したレンチウィルスベクターを構築し、それをヒト線維芽細胞に導入したレポーター細胞を作製した。また、ポジティブコントロールとして用いる目的で、既にRPE細胞への分化誘導系が多数報告されているiPS細胞にも上記レポーターベクターを挿入した細胞を作製した。いくつかの既存の方法によりiPS細胞からRPE細胞への分化誘導法を試みたが、作製したレポーターiPS細胞におけるGFP陽性細胞の割合が極めて低かった。そこで、RPE初代培養細胞にもレポーターベクターを導入したが、GFPの発現が非常に限定的であった。遺伝子Aプロモーターの応答性が悪いと考えられたため、同様の手法によりRPE細胞マーカー遺伝子Bのプロモーター領域を用いてレポーター細胞を作製し、そのレポーター強度をRPE初代培養細胞にも導入して確認した。その結果、マーカー遺伝子Bのレポーターはマーカー遺伝子Aよりも感度良く機能することが確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ひきつづき様々な低分子化合物の組み合わせを検討し、RPE細胞の直接誘導法の開発を目指す。その際に、昨年度に作製したRPEマーカー遺伝子Bのプロモーター領域を組み込んだレポーターシステムを用いる。しかしながら、作製したレポーターはかなり成熟したRPE細胞でのみ応答が確認できたため、RPE細胞への分化が段階的に起こることを想定した場合、途中の分化状態を評価するのには適さない可能性が考えられる。個体発生においてはRPE細胞への分化は神経外胚葉を経由するため、RPE細胞へと分化誘導する前段階として神経外胚葉の方向へ分化誘導される可能性も考えられる。そこで神経外胚葉特異的なマーカー遺伝子で、かつRPE細胞でも発現が確認できる遺伝子のプロモーターを用いたレポーターシステムの作製も並行して行い、今後の実験に供する。
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