2018 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of new purification method for bone collagen and functional analysis of bone-related cells by comparing gene expression levels
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17K01398
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
森本 康一 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (10319741)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | コラーゲン / 骨組織 / 骨細胞分化 / 翻訳後修飾 / LC-MS/MS / 培養足場 / 軟組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
I型コラーゲンは同一遺伝子から転写翻訳されるが、真皮などの軟組織と骨などの硬組織の両方に含まれる。真皮では線維芽細胞、骨では骨芽細胞、腱では滑膜細胞がそれぞれコラーゲンを主に生合成していると考えられる。コラーゲンは組織構造が異なる場に豊富に存在することから組織の形成維持に関与していると考えられるが、組織構造の差異とコラーゲン構造との関連性は未だ明らかではない。組織構造の特性を明らかにするためには、硬組織のコラーゲンを回収してその分子構造や会合体形成能などを調べ、真皮コラーゲンと比較しなければならない。さらに、組織特有のコラーゲンの翻訳後修飾を調べる必要がある。しかし、そのような研究報告は今までに見つからない。昨年度の研究では骨組織から天然構造を保持したコラーゲンの精製法を確立し、骨コラーゲンをLC-MSに供試した。本年度の研究では、豚骨から精製した骨コラーゲンのα1鎖とα2鎖の翻訳後修飾をLC-MSを駆使することで精度よく同定することに成功した。特にプロリン残基の水酸化修飾を各α鎖で調べ、定性解析を終えた。その他に本年度は、真皮と腱のコラーゲンの翻訳後修飾の数と修飾位置の均一性を確認した。そのためLC-MSのペプチド検出条件として、強度の高い残基は定量解析も実施し、信頼度95％以上の配列を採用することにした。その結果、組織ごとの修飾情報を抽出して組織（真皮、腱、骨）間の共通修飾と修飾種の差異などを比較した。また、円二色性スペクトル測定装置を用いて独自の方法を組み合わせて高感度に転移温度を調べ、各組織の水酸化修飾数の増減との相関を検証した。組織により翻訳後修飾に違いがあることの確証を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、LC-MS/MSを用いてコラーゲンのα1鎖とα2鎖の翻訳後修飾の定性解析を終えた。独自に開発した方法で骨コラーゲンを精製し、真皮と腱コラーゲンは国内で市販されている３社の製品（真皮３社と腱２社）を購入して調べた。その結果、同じ真皮コラーゲンにおいても製造者間で水酸化したプロリン残基に共通する多数の位置と異なる少数の修飾位置があることが示された。腱コラーゲンのプロリン残基も全て同じ水酸化修飾ではなかった。この結果は想定外であったが、今後の解析に有益な情報となった。また、骨コラーゲンのプロリン残基の水酸化も精密に同定した。各組織（製造者間）で共通した水酸化修飾を元に、真皮と腱、骨を比較解析してその差異を調べた結果、水酸化総数とコラーゲン分子の転移温度（円二色性スペクトル装置で高感度測定）に正の相関があることが示された（Ａ社41.8℃/517個、Ｂ社41.2℃/459個、Ｃ社40.4℃/423個）。水酸化修飾はコラーゲン分子の熱安定性を高めることが知られるので、コラーゲン製品のプロリン残基の水酸化修飾数と性質が関連していることが示され、化学製品との違いが明らかになった。リン酸化においても同様に共通した修飾残基を用いて解析すると、組織間で興味深い違いが認められた。予想外に骨コラーゲンのリン酸化修飾が少ないことが示された。コラーゲンのリン酸化はリン酸カルシウムやリン酸化タンパク質の結合に関連し、コラーゲンの線維形成とその安定性にも大きく影響するので、骨でリン酸化修飾が低いという発見は重要な知見である。これら翻訳後修飾の差異が組織構造と関連している可能性が強く考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定では、組織ごとのコラーゲン翻訳後修飾に製造者間差はないと信じていた。よって組織間差を市販製品にて明確にできると計画したが、実際には３社の真皮コラーゲン製品と２社の腱コラーゲン製品で水酸化プロリンの数と修飾位置に違いがあった。そのため、研究計画の変更を考慮する必要が生じた。製造者間差の解決策として、製造方法に違いがあると考え、研究室でブタの真皮と腱を原材料として骨と同様に調製するように研究計画を変更して注力することにする。つまり、各組織のコラーゲン調製法と実験者を統一することで、その変位を最大限に抑制する方針である。その上で、再度LC-MS/MSを駆使して、プロリン残基の水酸化数と修飾位置、リン酸化の総数と修飾位置を同定し、組織間で翻訳後修飾を比較解析する。ただし、原材料の由来（ブタの個体差や、飼料、飼育環境など）による変位は低減できない。
その後、当初の計画通りに独自に調製した骨コラーゲンを培養皿に塗布し、ラット頭蓋骨由来骨芽細胞を培養し、細胞機能（石灰化能や分化維持能など）を調べることに徹する。具体的には、アルカリホスファターゼ活性とアリザリンレッド染色を指標として骨コラーゲンに由来する石灰化誘導能を評価する。また、RT-qPCRにより遺伝子発現パターンを解析して分化能を解析する。最終的には、骨コラーゲンの有用性を真皮由来コラーゲンと比較検討し、差別化できるかを評価する。
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| Causes of Carryover |
当初予定では、本年度に初代細胞と専用培地などを購入して実験する予定であった。つまり、培養足場として使用するコラーゲンの翻訳後修飾を明確にして、細胞培養実験を開始することにより骨コラーゲンの優位性を検証する計画であった。しかし、製品コラーゲンのLC-MS/MSの結果より、軟組織コラーゲン製品の翻訳後修飾に製造者間差が存在することが明らかになった。本年度は、その解析と対策に注力したため、細胞培養まで実施できなかった。そのため、その予算を次年度に執行することにした。つまり、計画していた実験は翌年度に実施予定なので、評価する細胞の購入費用などに充当する。
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