2018 Fiscal Year Research-status Report
Experimental Investigation of structural protein dynamics for metalloenzyme functions
| Project/Area Number |
17K01947
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
松尾 貴史 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (50432521)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 金属酵素 / サブチリシン / 金属配位 / 補助配位子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
金属含有酵素の機能の発揮箇所である中心金属イオン部分の反応性は、金属配位部位の局所的な構造効果のみならず、生体高分子全体の構造柔軟性とカップルしていることを、昨年度の研究で実験的に明らかにした。しかし、構築したチオールサブチリシン内Cu(II)錯体の配位に関与するアミノ酸残基は、タンパク質構造の幾何学的配置から、Cys、Hisのみであるため、その後の研究展開に支障があると予想された。そこで、今年度は、昨年度の研究で用いたチオールサブチリシンのCys221に対して、化学修飾を行ない、補助配位子の導入を検討し、遷移金属イオンの結合能について検証した。
2-ブロモメチルピリジンを化学修飾剤として作用させたところ、メチルピリジン部分に相当する質量増加が観測された。この化学修飾タンパク質に対して、遷移金属イオンの配位能を検討したところ、Cu(II), Zn(II), Ru(III)等、金属イオンの結合をICP-MS、UV-visによって確認できた。化学修飾を施さなかったチオールサブチリシンと、金属結合能について、EDTAによるキレート除去実験によって比較を行ったところ、メチルピリジンを導入した化学修飾チオールサブチリシンの方が、これらの金属イオンを強く結合する結果が得られ、ピリジン部位が補助配位子として機能していることが明らかとなり、簡便な化学修飾で、新たな金属錯形成場を構築することが可能であることが示された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
簡便な方法による新たなタンパク質金属錯体の構築が可能であることが示され、人工金属酵素の反応性と、生体高分子全体の構造柔軟性との相関関係を実験的に検証するモデルタンパク質として利用できる素材が得られた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
構築したタンパク質内金属錯体上での触媒反応活性の検討と、生体高分子の構造柔軟性と触媒活性との相関関係を実験的に検証する。
|
| Causes of Carryover |
29年度および30年度に実施予定であった蛋白質の結晶構造解析において、結晶化には成功したものの高分解能の構造解析のために、さらなる条件検討が必要となった。また、タンパク質内金属錯体の反応性に対するタンパク質構造柔軟性効果の伝搬様式を検討するために、変異体発現系の構築を行ったが、得られたタンパク質の安定性に問題が生じたため、別種類の変異体作成の必要性が生じた。このため、生化学実験試薬の購入および学外実験に伴う機器使用代、旅費に使用する予定である。
|
