抗原虫活性物質の結合タンパク質同定と新規創薬ターゲットの開拓

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K01951
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 石山 亜紀 北里大学, 感染制御科学府, 特任助教 (70300746)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: Target protein fishing / 原虫感染症 / マラリア原虫 / リーシュマニア原虫

Outline of Annual Research Achievements

Nilotinibの標的タンパク質を同定するためにマラリア原虫の大量培養を行い原虫ライゼート(細胞質フラクション、核フラクション)の調整を継続して行っている。リガンド結合ビーズの作製も継続して行っていたが、リガンド結合量とSDS-PAGEで確認されるバンドから推測されるタンパク質量に再現性が見られなくなっていたため受託により結合ビーズを作製した。その結果、リガンドの実質結合量が調整量の1/2となっていたため、リガンド結合量の条件をこれまでの２倍として作製された結合ビーズを用いてtarget protein fishingを行った。 細胞質フラクションを用いた検討ではSDS－PAGE上で3 -５本程度の結合タンパク質が確認された。これまで数回の検討を実施したなかで、再現性の高いバンド２本(37kDa, 30kDa付近)をゲルから切り出した。解析は前回検討したMALDI-TOFF-massによるPMF法ではなく、より感度の高いLC/MS解析を実施中である。
リーシュマニア原虫を用いたtarget protein fishingの最適化に向けて内臓リーシュマニア原虫のamastigote型(細胞内感染型)からライゼートを得るために大量取得および培養の検討を継続している。マクロファージ等の宿主細胞に対して十分な感染力を維持したリーシュマニア原虫を得るために定期的なマウスpassegeによって標的臓器である脾臓からamastigoteを分離しin vitro 培養を行った。本法によってホストマクロファージ細胞に感染力のあるamastigoteが得られているものの、得られるamastigoteの量、in vitro培養での維持、細胞増殖度が一定しないためtarget protein fishingに使用する原虫ライゼートを調整するまでの原虫量確保には達していない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度の問題であったリガンド結合ビーズに関しては解決したものの、マラリア原虫の培養に滞りがあったこと、同じくリーシュマニア原虫の取得、培養が順調とは言えない。

Strategy for Future Research Activity

Nilotinibの結合タンパク質取得においては核タンパク質フラクションを用いた検討を進める。細胞質および核タンパク質フラクションの標的タンパク質候補のバリデーションに進む。Nilotonibの作用機序を解明する上で、結合タンパク質以外の部分でも検討を進める。