2018 Fiscal Year Research-status Report
RNase Hを利用したmRNAの増幅的検出法の開発と薬剤スクリーニングへの応用
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17K01965
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
春木 満 日本大学, 工学部, 教授 (30273593)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | RNase H / DNA/RNAヘテロ二重鎖 / RNA発現解析 / RNA検出プローブ / 薬剤スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，標的RNA依存的にRNase Hにより切断され，蛍光シグナルが蓄積して増幅されることにより，微量のmRNAを検出する新規プローブを開発することを目的とする。作製するプローブ配列は，AU塩基対９個からなるステム＆ループ構造をとり，標的配列が存在しない場合はDNA部分と2’-Oメチル化されたRNAが対合してRNase Hにより切断されないようにする。標的配列に相補的な配列を両端に付加し，さらにステム形成のためのクランプ配列を付加する。5’末端をFITC，3’末端をそのクエンチャーでラベルし，モレキュラービーコン型構造とする。標的配列が存在する場合は，標的配列に相補的な部分と塩基対を形成し，ステム部分の塩基対がずれてDNA部分と非修飾RNAが対合してRNase Hにより切断されるようになると期待される。
最初に設計したプローブ１は，プローブ単独でRNase Hにより切断されてしまうことが判明した。これはAU塩基対がずれて形成されることにより，DNA部分とメチル化されていないRNAが対合してRNase Hにより切断されたと考えられる。そこで，AU塩基対のステムに隣接する部分にGC塩基対を２個導入したプローブ２を作成したが，ステム構造が安定すぎてターゲットに結合しにくいことが示唆された。さらに，UA塩基対をAU塩基対間に導入することにより塩基対のずれを防止したプローブ3を作成した。このプローブは、単独はRNase Hによる切断を受けず，プローブとターゲットRNAのハイブリダイズも確認できた。ハイブリダイズ後にRNase Hを加えると切断が見られた。現在，少量のターゲットにプローブを加えた場合にターンオーバーするかを確認中である。また，切断効率が低いので，さらに新たなプローブの作成を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画では，作成したプローブを培養細胞に導入し，mRNAの検出の確認までを行う予定であった。しかしながら，当初に設計したプローブは，単独でもRNase Hにより切断されてしまい，改良したプローブではRNase Hには切断されないかわりにターゲットRNAに結合しにくかったり，RNase Hによる切断効率が低いなどプローブ設計に難航しており，最適化までには至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
プローブ３はRNase Hによる切断効率が低いことが判明したので，ステム部分を長くするなどの検討を行う。また，効率よくターンオーバーするように配列を最適化する。プローブが最適化でき次第，細胞内でRNAを検出する実験および薬剤スクリーニングを実施する。
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| Causes of Carryover |
前年度は，反応条件検討のためのプローブやターゲットRNAなどの試薬を主に購入した。必要な費用は予定より少なかったため未使用の研究費が若干生じたが，配列の最適化が達成されておらず，次年度にその費用として必要である。当初の次年度分の研究費は，作成したプローブにより細胞内でRNAを検出する実験および薬剤スクリーニングに使用する予定である。
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