Development of amplificative detection of mRNA using RNase H and its application for drug screening

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K01965
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 春木 満 日本大学, 工学部, 教授 (30273593)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: RNase H / DNA/RNAヘテロ二重鎖 / RNA発現解析 / RNA検出プローブ / 薬剤スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，標的RNA依存的にRNase Hにより切断され，蛍光シグナルが蓄積して増幅されることにより，微量のmRNAを検出する新規プローブを開発することを目的とする。作製するプローブ配列は，AU塩基対９個からなるステム＆ループ構造をとり，標的配列が存在しない場合はDNA部分と2’-Oメチル化されたRNAが対合してRNase Hにより切断されないようにする。標的配列に相補的な配列を両端に付加し，さらにステム形成のためのクランプ配列を付加する。5’末端をFITC，3’末端をそのクエンチャーでラベルし，モレキュラービーコン型構造とする。標的配列が存在する場合は，標的配列に相補的な部分と塩基対を形成し，ステム部分の塩基対がずれてDNA部分と非修飾RNAが対合してRNase Hにより切断されるようになると期待される。
UA塩基対をAU塩基対間に導入することにより塩基対のずれを防止したプローブ3では，ターゲットRNAを1:1で加えた場合はRNase Hによる切断が見られたが，加えるターゲット量をプローブの1/10にした場合にはプローブのターンオーバーは見られなかった。ターンオーバーしやすくするために，プローブ3の5’側と3’側の鎖長を1塩基ずつ短くしたプローブ４を作製し，加えるターゲット量をプローブの1/10にした場合，プローブ3の場合と比較してプローブ４では切断断片の顕著な増加が見られた。さらに，ターゲットの5’側と3’側を1塩基ずつ短くしたターゲットを用いて，プローブ４に対して1/10量加えてRNase Hによる切断を行ったところ，加えたプローブがすべて切断された。したがって，プローブがターンオーバーし，少量のターゲットRNAを増幅的に検出することに成功した。