Screening of cancer cell 3D invasion inhibitors from microbial metabolites

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K01967
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 梅澤 一夫 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70114402)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小出 直樹 愛知医科大学, 医学部, 教授 (50308962)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: がん細胞 / 浸潤 / 遊走 / 放線菌 / スクリーニング / NF-kappa B / IKK-beta / 三次元培養

Outline of Annual Research Achievements

がん細胞の遊走・浸潤阻害剤は転移を抑制し、毒性の少ない抗がん剤に発展する可能性がある。そこで私たちは放線菌からMDA-MB-231細胞の遊走を阻害する低分子化合物を探索した。遊走測定にはwound healing assayを用いた。数百の放線菌培養液を検索した結果、1株の培養液に活性がみられ、単離・構造決定したところ、活性本体は1960年代に抗生物質として放線菌培養液から発見されたketomycinと同定された。ketomycinは毒性のない濃度でヒト乳がんMDA-MB-231細胞とMCF-7細胞のマトリゲルチャンバー法における浸潤も阻害した。機構解析のためにMDA-MB-231細胞を用いてhuman tumor metastasis arrayで解析したところ、ketomycinによりMMP-9とMMP-11の発現が低下することがわかった。それぞれをsi-RNAでノックダウンすると、遊走能および浸潤能が低下した。上流の機構としてketomycinは細胞内NF-kappa Bを阻害した。さらに上流では細胞内IKKのリン酸化を阻害し、IKK-betaのin vitro活性を阻害することからketomycinは新しいIKK-beta阻害物質であることがわかった。そしてketomycinは毒性のない濃度で、MDA-MB-231細胞の三次元浸潤も阻害した。三次元培養でのNF-kappa B活性も低下させた。ketomycinは細胞毒性が低く、in vivoでも転移モデルを抑制する可能性がある。そのほか、がん細胞の2Dおよび3D浸潤を阻害するDHMEQがPM2.5誘導細胞炎症モデルを阻害し、軟膏はアトピーモデルを阻害すること、やはりがん細胞の浸潤を阻害する植物性アルカロイドconophyllineがマトリクス形成やin vivo高脂肪食誘導NASHを阻害することを報告した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

2017年度には微生物由来マクロライド化合物IKD8344が、がん細胞の浸潤抑制を示すことを発見し、特許を出願した（特願2017-193428）。2018年度には放線菌培養液から既知抗生物質ketomycinに2Dおよび3D浸潤阻害活性があることを見出し、論文として発表した。機構研究においてもketomycinは新しいIKK-beta阻害剤であり、IKK-betaに直接結合することもことを最近見出したので、2019年度に、もうひとつketomycinの論文を投稿する予定である。学会発表や論文発表して広く成果を発信することも目的にしているが、2018年度9件の論文発表と7件の学会発表をした。以上の内容を含め、シグナル田たち阻害剤の探索と応用についてノルウェーのベルゲン大学とポーランドのポズナン医科大学で、講演をした。このように2年目までに特許出願の面と科学的に2Dおよび3D浸潤を阻害する新規活性化合物を見出して機構解析したこと、そして成果が論文発表、学会発表、講演に結びついていることから、当初の計画以上に進展している、とした。

Strategy for Future Research Activity

2019年度はketomycin のがん細胞の2D、3D浸潤を阻害する分子レベルの機構を解明し、論文として完成させる。in vitroでIKK-betaを阻害し、下流のNF-kappa Bを阻害することがわかった。ビアコアを用いて、酵素と阻害剤の結合を確認し、さらに、ペプチド、ATPのどちらと競争するかを調べる。細胞の遊走を阻害する物質は血管内皮細胞の管腔形成を阻害する可能性が高い。そこでHUVECを用いて、VEGFに誘導される管腔形成の阻害を調べる。阻害すれば、in vivo血管新生アッセイ系の構築を計画し、ketomycinの阻害活性を調べる。
2017年度にマクロライド構造を持つ微生物由来既知化合物IKD8344がヒト卵巣がんES-2細胞の遊走・浸潤を阻害することを見出し、新規活性として愛知医科大学から特許を出願した。2019年度はこの化合物のMDA-MB-231細胞における2D、3D浸潤活性を調べ、阻害すれば機構を解析する。
一方、最近、中国の深せん大学との共同研究で、南シナ海2400 mの深海で採取されたカビAspergillusから、RAW264.7細胞のNO産生を阻害する既知benzodiazepine化合物、cyclopenolとcyclopeninを単離した。これらの化合物のMDA-MB-231細胞の2D、3D浸潤阻害活性を調べ、阻害の機構を解析する。
MDA-MB-231細胞を用いた放線菌からの低分子遊走阻害物質のスクリーニングを続ける。平行して、RAW264.7細胞における放線菌由来LPS誘導NO産生阻害物質のスクリーニングを行う。いずれかでヒットした培養液から活性本体を単離・精製・構造決定して、がん細胞の3D浸潤を阻害する新規化合物発見を目標にする。

Remarks

愛知医科大学ホームページには研究室紹介のほか2012年以降の刊行論文が記載されている。梅澤ラボ・チャンネルには生理活性物質の探索法や、医薬として開発が進んでいるNF-kappa B阻害剤DHMEQの紹介がある。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Poznan University of Medical Sciences(ポーランド)
  • Country Name: POLAND
  • Counterpart Institution: Poznan University of Medical Sciences
• [Int'l Joint Research] Shenzhen University/Shenyang Pharmaceutical University(中国)
  • Country Name: CHINA
  • Counterpart Institution: Shenzhen University/Shenyang Pharmaceutical University
• [Int'l Joint Research] University of Bergen(ノルウェー)
  • Country Name: NORWAY
  • Counterpart Institution: University of Bergen
• [Int'l Joint Research] Bashkortostan State Medical University(ロシア連邦)
  • Country Name: RUSSIA FEDERATION
  • Counterpart Institution: Bashkortostan State Medical University
• [Journal Article] Isolation of ketomycin from Actinomycetes as an inhibitor of 2D and 3D cancer cell invasion (2019)
  • Author(s): Y. Lin, Y. Chen, T. Ukaji, S. Okada, K. Umezawa
  • Journal Title: J. Antibiot. Volume: 72 Pages: 148-154
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anti-Inflammatory effect of Dehydroxymethylepoxyquinomicin, a nuclear factor-kappa B inhibitor, on endotoxin-induced uveitis in rats in vivo and in vitro (2019)
  • Author(s): Y. Ando, H. Keino, A. Kudo, A. Hitrakata, A. A. Okada, K. Umezawa
  • Journal Title: Occular Immunology & Inflammation Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1080/09273948.2019.1568502
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Conophylline suppresses pancreatic cancer desmoplasia and cancer-promoting cytokines produced by cancer-associated fibroblasts (2019)
  • Author(s): N. Ishii, K. Araki, T. Yokobori, K. Hagiwara, G. Dolgormaa, T. Yamanaka, T. Handa, M. Tsukagoshi, T. Igarashi, A. Watanabe, N. Kubo, N. Harimoto, A. Masamune, K. Umezawa, H. Kuwano, K. Shirabe
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 10 Pages: 334-434
  • DOI: 10.1111/cas.13874
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The JAK/STAT3 and NF-kappa B signaling pathways regulate cancer stem cell properties in anaplastic thyroid cancer cells (2019)
  • Author(s): K. Shiraiwa, M. Mitsutake, Y. Nakazawa, T. Ogi, K. Suzuki, V. Saenko, K. Umezawa, S. Yamashita, K. Tsukamoto
  • Journal Title: Thyroid Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1089/thy.2018.0212., 2019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparison of anti-atopic dermatitis activities between DHMEQ and tacrolimus ointments in mouse model without stratum corneum (2019)
  • Author(s): H. He, X. Gao, X. Wang, X. Li, X. Jiang, Z. Xie, K. Ma, J. Ma, K. Umezawa, Y. Zhang
  • Journal Title: International Immunopharmacology Volume: 71 Pages: 43-51
  • DOI: 10.1016/j.intimp.2019.03.015
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] NF-kappa B inhibitor DHMEQ inhibits titanium dioxide nanoparticle-induced interleukin-1 beta production: Inhibition of PM2.5-induced inflammation model. (2018)
  • Author(s): H. Fukatsu, N. Koide, S. Tada-Oikawa, K. Izuoka, A. Ikegami, S. Ichihara, T. Ukaji, N. Morita, Y. Naiki, T. Komatsu, K. Umezawa
  • Journal Title: Molecular Medicine Reports Volume: 18 Pages: 5279-5285
  • DOI: 10.3892/mmr.2018.9533
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dehydroxymethylepoxyquinomicin suppresses atopic dermatitis-like lesions in a stratum corneum-removed murine model through NF-kappa B inhibition (2018)
  • Author(s): X. Jiang, H. He, Z. Xie, H. Wen, X. Li, Xin Li, J. Ma, K. Umezawa, Y. Zhang
  • Journal Title: Immunopharmacology and Immunotoxicology Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1080/08923973.2018.1510962
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Conophylline inhibits high fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in mice (2018)
  • Author(s): T. Ohashi, Y. Nakade, M. Ibusuki, R Kitano, T. Yamauchi, S. Kimoto, T. Inoue, Y. Kobayashi, N. Ishii, Y. Sumida, K. Ito, H. Nakao, K. Umezawa, M. Yoneda
  • Journal Title: PLOS One Volume: electronic Pages: electronic
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0210068, 2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The plant alkaloid conophylline inhibits matrix formation of fibroblasts (2018)
  • Author(s): T. Tezuka, A. Ota, S. Karnan, K. Matsuura, K. Yokoo, Y. Hosokawa, D. Vigetti, A. Passi, S. Hatano, K. Umezawa, H. Watanabe
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 293 Pages: 20214-20226
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Inhibition of titanium dioxide nanoparticle-induced inflammatory reaction by NF-κB inhibitor DHMEQ in human macrophage-like cells (2018)
  • Author(s): Hitomi Fukatsu, Tamami Ukaji, Saeko Tada-Oikawa, Kiyora Izuoka, Yoshikazu Naiki, Takayuki Komatsu, Naoki Koide, Akihiko Ikegami, Sahoko Ichihara, Kazuo Umezawa
  • Organizer: 21st International Symposium on Molecular Medicine
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Amelioration of metabolic syndrome and neurodegenerative disease models by plant-derived alkaloid conophylline (2018)
  • Author(s): Kazuo Umezawa
  • Organizer: 21st International Symposium on Molecular Medicine
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] がん細胞の遊走を阻害する放線菌由来ketomycinのスクリーニングと乳がんMDA-MB-231細胞における2Dおよび3D浸潤の抑制 (2018)
  • Author(s): Lin Yinzhi、梅澤一夫
  • Organizer: 第22回がん分子標的治療学会
• [Presentation] 新規NF-κB阻害剤SEMBLによる骨肉腫細胞および線維肉腫細胞に対する抗腫瘍効果 (2018)
  • Author(s): 松尾俊宏，梅澤一夫，松井卓哉，佐藤啓二，河南勝久，出家正隆
  • Organizer: 第91回日本整形外科学会学術総会
• [Presentation] PM2.5モデルTiO2ナノ粒子に誘導されるマクロファージのIL-1 beta産生とNF-kappa B阻害剤DHMEQによる抑制 (2018)
  • Author(s): 深津仁見、梅澤一夫、森田奈央子、内記良一、小松孝行、小出直樹
  • Organizer: 新規素材探索研究会第17回セミナー
• [Presentation] 放線菌由来細胞遊走阻害剤ketomycinの単離と乳がん細胞におけるMMP依存性浸潤の抑制 (2018)
  • Author(s): Lin Yinzhi、Wu Yanhua、梅澤一夫
  • Organizer: 第13回日本ケミカルバイオロジー学会
• [Presentation] Isolation of ketomycin from Streptomyces as an inhibitor of 2D and 3D invasion of human breast carcinoma cells (2018)
  • Author(s): Yinzhi Lin, Yanhua Wu, Kazuo Umezawa
  • Organizer: 第77回日本癌学会
• [Remarks] 愛知医科大学ホームページ
  • URL: www.aichi-med-u.ac.jp
• [Remarks] 梅澤ラボ・チャンネル
  • URL: www.umelab.net