2017 Fiscal Year Research-status Report
グラフェンを用いた硬／軟ハイブリッド基質によるヒト間葉系幹細胞の分化誘導
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17K05009
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| Research Institution | Nippon Institute of Technology |
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Principal Investigator |
伴 雅人 日本工業大学, 工学部, 教授 (70424059)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
沖川 侑揮 国立研究開発法人産業技術総合研究所, ナノ材料研究部門, 研究員 (50635315)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | グラフェン / 幹細胞 / 分化 / 神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、神経系疾患に対する細胞治療技術に資するための神経系細胞供給源として、ヒト間葉系幹細胞をより短時間で効率的に神経系細胞への分化誘導が可能な細胞足場用基質を提供することを全体構想とする。この中で、超高弾性率・導電率という特異な特性を持つグラフェンを付着させた軟質基質を伸展しグラフェンを微細なドメインに断片化させた「硬／軟ハイブリッド基質」を作製し、これを用いたヒト間葉系幹細胞の培養試験により、神経系細胞への分化誘導に対し、生化学因子を用いる手法の代替あるいはその効果を相乗的に高めることが可能な足場基質を設計することを目的としている。
当該年度は、まずグラフェンの存在効果の検証を行い、その結果、グラフェンが付着した軟質足場基質上でヒト間葉系幹細胞を培養すると、グラフェンが付着されていない同基質に比べ、その形態が大きく変化することを明らかにすることができた。具体的には、グラフェン付着基質では、細胞骨格（面積や周囲長）が増大すること、また、基本培地に比べ神経分化誘導培地を使用した場合には、その有意差がさらに大きくなることが示された。これらの結果は、軟質基質上のグラフェンが細胞骨格の伸展に明らかな影響を与えていることを示しており、分化誘導に関わる細胞形態の変化が発現された現象である可能性が示唆され、当該年度の作製・試験方法を継続して実施し、免疫蛍光染色などによる神経系細胞への分化評価を推進していく意義が示された。ただ、軟質基質へのグラフェンの付着や微細なドメインに断片化する方法には多くの問題があることも明確となり、分化誘導に対する効率的・時間的優位性を示す基質設計指針の知見を得るために、今後これらの課題を第一に克服していく必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、プラズマ支援CVD法により成膜した高品質グラフェンを軟質材料に転写付着させ、この基質を伸展させることでグラフェンを断片化させた「硬／軟ハイブリッド基質」を作製し、これを足場としてヒト間葉系幹細胞を培養し、その形態変化および分化誘導に関する評価を行うことが、計画の全体概要である。
当該年度は、軟質基質として当初計画していたアクリルアミドゲルにはグラフェンの転写が極めて困難であることが判明したため、その代替として硬化剤比率を調整し低弾性率（約40kPa）としたポリジメチルシロキサンを利用してグラフェンを転写し、硬／軟ハイブリッド基質を作製した。これと、コントロールとしてポリジメチルシロキサン（グラフェン無し）を足場として、神経分化誘導培地（含：レチノイン酸）のほか基本培地を用いて、ヒト間葉系幹細胞を2週間まで培養した。培養後、細胞固定し、蛍光染色により、細胞核および細胞骨格となるF-アクチンを蛍光顕微鏡にて観察・撮影し、得られた画像を解析することで、細胞数および細胞形態の定量データを得た。細胞数は、基本培地に比べ分化誘導培地を使用すると大きく減少し、また、グラフェン付着基質ではコントロール基質に比べさらに減少する傾向を示すことがわかった。1細胞当たりのF-アクチンの面積と周囲長については、コントロール基質に対し、グラフェン付着基質にて分化誘導培地を使用して培養した細胞がもっとも大きく、細胞骨格がより増大したことが判明した。さらに、当初計画である、より低弾性率（1kPa）でグラフェンのドメインサイズをコントローラブルに変化させた基質軟質を足場として使用するために、基質へのグラフェン転写、グラフェンの断片化、培養試験における基質の取り扱いなどの方法について検討を加える必要があることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的には当初計画の方案に従って研究を推進し、当該年度実施した基質の作製および細胞培養試験を次年度も継続して実施するが、遅れている部分としてまず早急に、免疫蛍光染色法にて4種のマーカー（MAP2、Tuj－1、nestinおよびGFAP）の発現を観察し、神経系細胞への分化の程度やその段階（グリア、ニューロン）について、グラフェンが基質表面（細胞付着面）に存在することの効果を検証する。さらに、遺伝子発現解析として、リアルタイムポリメターゼ連鎖反応（RT－PCR）装置にて、神経への分化などに関するマーカーの発現レベルを比較評価する。分化の程度・段階の評価結果は、当該年度に得られた細胞数および細胞形態に関する結果と比較をすることにより、それらの関係性について検討を加える。ここまでの成果にて一旦整理し、学会や論文などにて外部発信を行う。
これと並行して、当該年度に課題となった、低弾性率の軟質基質の作製とその表面へのグラフェンの転写手順、さらに、グラフェンを転写した後にそれをサイズの異なるドメインに制御性よく断片化する方法（転写する前にグラフェンを断片化してしまう方法も）について、試作による検討を行い、ドメインサイズと弾性率の異なる数種類の硬／軟ハイブリッド基質を作製する。これらを足場とした細胞培養試験および蛍光染色などによる評価を系統的に実施し、神経系細胞への分化誘導に対し、より効率的で時間的な優位性を示す基質の設計指針が示されるような基盤データを得る。
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| Causes of Carryover |
研究分担者における消耗品使用が計画より低額で収まったため次年度使用額が生じた。生じた次年度使用額は、翌年度分として請求した助成金と合わせて、引き続きグラフェン成膜実験における消耗品購入に充てる予定である。
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