2018 Fiscal Year Research-status Report
Single molecule observation and theoretical study of higher order structural change of DNA accompanied by DNA quadruplex formation
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17K05013
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
谷川 雅人 大分大学, 医学部, 教授 (90332890)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩城 貴史 大分大学, 医学部, 助教 (60416419)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | G-quadruplex / 円偏光二色性 / ストップトフロー / 全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF) |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TMPyPおよび類似の分子とDNA G-quadruplexとの相互作用を円偏光二色性（CD)スペクトルおよびCDストップトフローにより調べた。また、G-quadruplex構造をとるDNAがブラスミドやBACなど様々の長さのDNAのなかに存在するときに、この相互作用がどのように変化するかを調べた。この実験においては、TMPyPなどの小分子とDNAの非特異結合の影響を排除する必要があるため、スペクトル変化のなかで非特異結合によるものとG-quadruplexへの特異的な結合によるものを分離する解析方法を開発した。これらの結果を詳細に調べたところG-quadruplexの含まれるDNAの分子量依存性が見られることが分かった。これは、小分子がDNAにアクセスするときに周りのDNAによって妨げられているためであると考えられる。今後コンピューターを用いたシミュレーションを行いこの実験結果と比較することにより、さらに詳細な検討を行う予定である。
また、G-quadruplex構造をとるDNAがBAC DNAのなかに存在するときに自己相関関数がG-quadruplexを含まない時と変化するかを全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF)による一分子観察法により調べた。自己相関関数から緩和時間を求めて比較したが、緩和時間の誤差が大きくなり、これを考慮すると明確な違いは現時点では見出していない。しかし、BAC DNA分子量を変えることにより誤差範囲を小さくできることを見いだした。今後、この誤差範囲を小さくしたBAC DNAを用いてG-quadruplex構造をとるDNAがBAC DNAのなかに存在するとき存在しない時の緩和時間を比較することにより、DNA四重鎖構造をとることによるのDNA高次構造の変化を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画書（申請書）では平成３０年度に以下の４分野の研究を予定していた。Ⅰ－２小分子との相互作用による G-quadruplex安定性変化をCDのストップトフローによって明らかにする。Ⅱ－２長さの異なるBACを用いて、長さによる緩和時間への影響を明らかにする。Ⅱ－３G-quadruplexを含む208kbpのDNAについて、全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF)で一分子観察を行い、自己相関関数を調べ、緩和時間をG-quadruplexが含まれない場合と比較する。Ⅲ－２ １分子観察を行う長鎖DNAモデルを用いたシミュレーション計算を行い自己相関関数を求める。
いずれも計画通り進んでおり、Ⅰ－２ではTMPyPおよび類似の分子とDNA G-quadruplexとの相互作用を円偏光二色性（CD)スペクトルおよびCDストップトフローにより調べた。Ⅱ－２では、G-quadruplex構造をとるDNAがブラスミドやBACなど様々の長さのDNAのなかに存在するときに、TMPyPなどの小分子とDNAの非特異結合の影響を排除する必要があるため、非スペクトル変化のなかで非特異結合によるものとG-quadruplexへの特異的な結合によるものを分離する解析方法を開発し、G-quadruplexの含まれるDNAの分子量依存性が見られることが分かった。Ⅱ－３では、G-quadruplex構造をとるDNAがBAC DNAのなかに存在するときに自己相関関数がG-quadruplexを含まない時と変化するかを一分子観察法により調べ、自己相関関数から緩和時間を求めて比較した。Ⅲ－２では、計算の基となるモデルを作成して、短時間の計算を行い、モデルの妥当性を評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現時点では、概ね当初の計画通り研究は進んでいるので、今後の研究に関しても、当初計画通り、Ⅱ－３G-quadruplexを含む208kbpのDNAについて、全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF)で一分子観察を行い、自己相関関数を調べ、緩和時間をG-quadruplexが含まれない場合と比較するの後半とⅢ－３G-quadruplex構造を含む長鎖DNAのモデルの検討を行い、このモデルを用いたシミュレーション計算を行うことを予定している。また、TMPyPなどの小分子とG-quadruplexとの相互作用のDNAがブラスミドやBACなど様々の長さのDNAのなかに存在するときに、G-quadruplexの含まれるDNAの分子量依存性についても、コンピューターを用いたシミュレーションを行いこの実験結果と比較することにより、詳細な検討を行う予定である。Ⅱ－３については、BAC DNA分子量を変えることにより誤差範囲を小さくしたBAC DNAを用いてG-quadruplex構造をとるDNAがBAC DNAのなかに存在するとき存在しない時の緩和時間を比較することにより、DNA四重鎖構造をとることによるのDNA高次構造の変化を明らかにする。また、Ⅲ－３については、今年度に導入を予定しているシミュレーション用ワークステーションを用いて、本格的な計算を行い、モデルの妥当性を評価するとともに、詳細な分子の挙動を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
本年度に導入を予定していたシミュレーション計算用のワークステーションに搭載予定のGPUが、次年度に発売されるものでより効率的に計算できることが、今年度行った予備計算によって明らかになった。また、今年度は予定していた予備計算に加えて、様々の粗視化シミュレーション計算を行ったことから、本シミュレーション計算は次年度に行うことに予定を変更した。この粗視化シミュレーション計算の結果、当初予定していた分子動力学の計算に加えて、様々の粗視化シミュレーション計算を行ことにより、実験と近い状況を再現でき、より詳細な解析を行える可能性が出てきた。したがって、次年度にこれらの計算に耐えうるシミュレーション計算用をGPU搭載ワークステーションを導入する予定である。
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