2018 Fiscal Year Research-status Report

エピジェネティクス研究支援を指向する高精度低コストメチル化DNA検出法の開発

Research Project

Project/Area Number	17K05897
Research Institution	University of Fukui
Principal Investigator	高橋透福井大学, 学術研究院工学系部門, 准教授 (30361166)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	壹岐伸彦東北大学, 環境科学研究科, 教授 (50282108) 沖昌也福井大学, 学術研究院工学系部門, 教授 (60420626)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	DNAメチル化 / キャピラリー電気泳動
Outline of Annual Research Achievements	本研究計画では，DNAメチル化検出のためのA-G変異の識別に特化した核酸の溶液化学特性を利用する等鎖長配列異性体一本鎖DNAのCE分離法システムを構築し，より精密・高感度な分離・検出を達成し，これを基盤としたDNAメチル化検出システムを構築する．今年度は新たに項目「３．実試料系への適用」の一環として，口腔内がんの発症との関連が知られているヒトDNA断片試料（hTERT遺伝子断片）のホモなメチル化検出を実現するための基礎的な検討を行った．本研究で提案する手法では，バイサルファイト処理を行った後，PCRによって増幅したDNAに対してCE分離によってメチル化検出を行うことを想定している．バイサルファイト処理により，非メチル化シトシンはウラシルに変換され，PCRの際ウラシルはチミンとして読み取られるので，それに対応する相補鎖上の部位はアデニンとして増幅される．一方，メチル化シトシンはバイサルファイト処理により変化せず，PCRの際それに対応する相補鎖上の部位は通常通りグアニンとしてとして増幅される．従って，CE分離により，PCR後の相補鎖の配列上でメチル化部位に対応する箇所の塩基がアデニンかグアニンのいずれであるかを識別することができればメチル化検出が可能である．hTERT遺伝子から99塩基長の領域を選択し，ホモな非メチル化試料を想定（オリジナルの配列に対し，当該領域に含まれる5カ所のシトシンがウラシルに置換されたと想定）した一本鎖DNA試料（ターゲット配列相補鎖の配列上で五カ所のグアニンをアデニンに変換したもの）とメチル化試料を想定した一本鎖DNA試料（グアニンからアデニンへの変換なし）を作成し，これらのCE分離を行い，相互分離を達成することができた．すなわち，本計画で提案するCE分離に基づく手法により，実際のDNA試料系においてホモなメチル化の検出が可能であることが示唆された．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の研究計画で計画した本年度までに取り組むべき項目については着手ずみであり，それぞれについて概ね良好な結果を得ている．
Strategy for Future Research Activity	基本的に当初の計画に示した諸項目についてそれぞれ検討を行い，研究計画を推進する．今年度より着手した検討項目「３．実試料系への適用」では，現在検討を行っているhTERT遺伝子以外の他の遺伝子断片にも系を拡張して検討を行う予定である．
Causes of Carryover	今年度分の消耗品類の使用量が当初の見込みに対して少なかったが，研究計画の最終年度である次年度は，消耗品費に加え旅費の支出が増加するため，最終的には計画通りの使用額となる．