2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a new immune-response marker using electrophoresis
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17K05907
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
志村 清仁 福島県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (30130008)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 弘行 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (30322340)
長井 俊彦 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (90180447)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | キャピラリー / 等電点電気泳動 / アフィニティーカラム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
T細胞クローナリティーアッセイを実現するにあたり、等電点電気泳動用キャピラリーに結合するマイクロアフィニティーカラムの開発をさらに進めた。PMMA製の円盤状カラムプレートのカラム穴に多孔性モノリスカラムを作成し、クロマト担体として用いた。クロマト担体はエポキシ基を有するので、このエポキシ基にタンパク質を反応させて固定化した。カラムプレートのカラム穴の内径は0.5 mmだが、このサイズの細孔を精度良く開けるのは技術的にやや困難であることが分かった。そこで、同程度の内径を持つガラス管をクロマト管として用い、あらかじめモノリス担体をガラス管内に作成し、カラムプレートの孔にガラス管を挿入することによって作成する方法が有望であることが判明した。
モノリスカラムはモノマー、架橋剤、ならびにポロジェン量を調節することにより、流れに対する抵抗の低いカラムを作成することができた。孔径が増すほど流量抵抗は減少するが、また結合容量も低下する。しかし、1 マイクログラム程度の結合容量は容易に達成でき、キャピラリー等電点電気泳動分析に必要なタンパク質量は１ピーク当たり0.2 マイクログラム程度で十分なため、その結合容量でも十分であることが分かった。
タンパク質をカラムに固定化する反応としては、上で述べたようにモノリスカラムのエポキシ基を直接利用することができる。エポキシ基とタンパク質との反応は若干速度が遅く、また比較的高いpHの反応条件が必要であるという問題点もある。その点を解決するには、エポキシ基をアンモニアと反応させて一旦アミノ基を導入し、このアミノ基をジスクシニミジルカーボネート等で活性化して反応させる方法があり、有望であることがわかった。
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