2017 Fiscal Year Research-status Report

酸化剤を用いたDNAメチル化率のピンポイント解析法の開発

Research Project

Project/Area Number	17K05911
Research Institution	Tokyo University of Technology
Principal Investigator	加藤輝東京工科大学, 応用生物学部, 教授 (00367195)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	エピジェネティクス / がん診断 / メチル化 / メチルシトシン
Outline of Annual Research Achievements	電気泳動不要のシトシン／メチルシトシン識別のために、定量的PCR（リアルタイムPCR）の利用を検討した。p16遺伝子由来の54塩基の標的DNA中の1塩基のシトシン／メチルシトシンがthree-way junction（TWJ）構造の分岐点上に位置するように設計した2本のプローブDNAを標的DNAに結合させ、この状態で過マンガン酸カリウムを加えて分岐点上のメチルシトシンを1時間酸化した後、標的DNAを鋳型として定量的PCRを行った。その結果、メチルシトシンを含む標的DNAのCt値（threshold cycle）が同じ位置にシトシンを含む標的DNAより3～4程度高い値となり、定量的PCRによる1塩基のシトシン／メチルシトシン識別に成功した。また、RB1遺伝子由来の80塩基の標的DNAについても同様に、2本のプローブDNAを結合させて酸化と定量的PCRを行い、標的DNA中の1塩基のシトシン／メチルシトシンを識別できることを確認した。つぎに、定量的PCRによるシトシン／メチルシトシン識別のための最適な酸化条件を検討した。過マンガン酸カリウムの酸化力は酸性で高いが、TWJ構造を含めたDNAの高次構造は中性のpHで安定であり、バッファーの塩濃度もDNAの高次構造の安定性に影響するため、バッファーのpHと塩濃度を検討した。具体的には、酸化反応用バッファーのpHを4.5～6.0、ナトリウムイオン濃度を100～1000 mMの範囲で検討した。その結果、pH5.0、ナトリウムイオン濃度200 mMにおいて最もCt値の差が顕著となった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 当初は30年度に実施予定であった、酸化後の定量的PCRに使用するPCR用DNAポリメラーゼの検討を前倒しで実施した。具体的には、シトシン／メチルシトシン識別に最適な、すなわち、酸化されたメチルシトシンによりDNA伸長が最も強く阻害されるPCR用DNAポリメラーゼ（ExTaq、KODなど）を検討した。その結果、使用したいずれのポリメラーゼでもメチルシトシンを含む標的DNAのCt値がシトシンを含む標的DNAより高い値となったが、KODを使用したときに最もCt値の差が顕著となった。
Strategy for Future Research Activity	1. TWJを形成するプローブDNAのデザインの検討本解析法では、2本のプローブDNAと標的DNAが形成するTWJ構造の安定性が、分岐点上のメチルシトシンの酸化反応効率と検出感度に影響すると考えられる。そこで、プローブDNAの標的DNAに対する「相補鎖部分」の鎖長と、標的DNAの配列とは無関係に任意に設定できる「ステム部分」の配列、鎖長を検討し、定量的PCRでシトシン／メチルシトシンをより明確に識別できる条件を見出す。 2. 2本鎖標的DNA中のCpGメチル化の検出実用的なメチル化検出法を確立するためには、2本鎖DNA中のシトシン／メチルシトシン周辺にプローブDNAを結合させてTWJを形成させる必要がある。そのためには、2本鎖標的DNAを部分的に解離させなければならない。このために最適なプローブDNAの濃度、熱変性の条件、塩濃度などを検討する。熱変性の条件検討を効率良く網羅的に行うため、温度グラジエント機能付きサーマルサイクラーを使用する。以上の条件検討の結果、TWJを効率的に形成させる条件を見出せなかった場合は、DNAの2重らせん構造を解離させて1本鎖DNAと強固に対合する性質を持つ人工核酸である、ペプチド核酸（PNA）やLocked nucleic acid（LNA）などをプローブDNAとして使用することを検討する。
Causes of Carryover	29年度に前倒し請求した直接経費40万円を用いて、当初は30年度に実施予定であった、酸化後の定量的PCRに使用するPCR用DNAポリメラーゼの検討を実施したが、当初の予定よりも検討するPCR用DNAポリメラーゼの種類を絞り込んだため、次年度使用額28,176円が生じた。この次年度使用額も、30年度分の請求額と合わせて、「今後の研究の推進方策」に記載の「TWJを形成するプローブDNAのデザインの検討」と「2本鎖標的DNA中のCpGメチル化の検出」を行うための試薬、消耗品の購入に使用する予定である。