2018 Fiscal Year Research-status Report
Real time analysis of virus infection using Raman spectroscopy
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17K05914
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
佐藤 英俊 関西学院大学, 理工学部, 教授 (10300873)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ラマン分光法 / ウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は計画に沿って，DNAウイルスであるアデノウイルスに続き，レトロ（RNA）ウイルスであるレンチウイルスを用い，感染に対するHEK293細胞の応答について研究を進めた。アデノウイルスと同様に，感染3時間で細胞のラマンスペクトルに変化が観測され，ウイルス感染の検出が可能であることが示唆された。
レトロウイルスのRNAゲノムは逆転写酵素を経て宿主染色体に組み込まれる。本研究に用いたレンチウイルスは遺伝子組み込み実験用で，カプシドタンパク質を別に合成して与えなければウイルスとして発現することは無い。従って，HEK293に感染すると，組み込み用に与えたEGFPゲノムを宿主細胞に組み込むが，ウイルス自身が増殖することは無い。今回観測されたラマンスペクトルの変化は宿主細胞の変化のみを反映していることが分かる。
感染後3，6，12，18，24時間での分析を行ったが，感染細胞のうち50-90％だけに変化が観測された。ウイルス濃度は細胞数に比較して高く，レンチウイルスによる遺伝子導入効率も非常に高いことから，遺伝子発現の停止が生じていることが示唆された。レトロウイルスは感染後に一部の細胞で遺伝子発現を停止し，免疫系によって完全に除去されることを防止する能力を持つ。ラマンスペクトルの解析の結果，非感染-感染細胞を判別するスペクトル成分には，DNAと見られるバンドが強く観測され，遺伝子の複製活動が活性化していることを示唆した。蛍光観測では，EGFPの発現は24時間後でも細胞の30％程度に過ぎず，転写されたタンパク質がスペクトル変化の原因では無いことを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アデノウイルスと異なるレンチウイルスに関する結果を得ることができた。ヘルペスウイルスは利用していない。キャプシドタンパク質の精製は試験に成功しており，来年度早々に実験に取りかかる準備ができている。予定していたLC-MSの応用は遅れているが，RT-PCRの導入によりレトロウイルスであるレンチウイルスの分析が容易になった。アデノウイルス，レンチウイルスが共に増殖できる293T細胞導入のアイディアを得ることができたため，LC-MSを利用しなくても，ウイルス感染に対する細胞の反応を研究することができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
HEK293細胞で増殖可能なアデノウイルスと，遺伝子組み込みしか生じないレンチウイルス，レンチウイルスの外殻であるキャプシドタンパク質に対する細胞の反応を比較し，感染に対する細胞の変化をスペクトル変化の相関を明らかにすることを目指す。アデノウイルスとレンチウイルスの比較によって，ウイルス種の違いによる細胞の初期反応の違い，すなわちウイルス種の早期判別の可能性を検証する。初期反応は侵入してきた外殻タンパク質への細胞の反応であり，細胞のウイルス判別能に関する知見が得られる。アデノウイルス，レンチウイルスが共に増殖できる293T細胞を用いる場合，増殖による産物の違いを検出することとなる。従って，ラマン分光分析による判別が可能である場合は，増殖産物の異なるウイルスは全て判別できることを示唆する。レンチウイルスとキャプシドタンパク質を比較した場合，早期のスペクトル変化が細胞の異質ゲノム侵入と異質タンパク質侵入のどちらに対する反応かを知ることができる。
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| Causes of Carryover |
交付金額ぴったりとなるような物品が無かったため，やむを得ず9円の残金を翌年度に回すこととなった。翌年度に請求する助成金と合わせて計画通りに使用する予定である。
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