2017 Fiscal Year Research-status Report
蛍光分子の2段階成熟による環境応答性センサー型分子の取得
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17K05925
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| Research Institution | The University of Electro-Communications |
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Principal Investigator |
瀧 真清 電気通信大学, 大学院情報理工学研究科, 准教授 (70362952)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | コンビナトリアル合成 / ねじれ型分子内電荷移動 / スズキカップリング / ファージディスプレイ / 環境応答性蛍光分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、新規環境応答性蛍光分子のコンビナトリアル合成と標的蛋白質に対するスクリーニングを行った。
まず、ねじれ型分子内電荷移動（TICT; twisted intramolecular charge transfer）型の新規環境応答性蛍光分子ライブラリーをスズキカップリング反応にて網羅的に迅速合成した。次に、各化合物における環境応答性の有無を、緩衝溶液中で有機溶媒存在の有無にて蛍光応答性を示すかどうかスクリーニングすることで確認した。さらに上記スクリーニングにおいて明確な応答性が確認された化合物群を合成し、この中から標的蛋白質に対して弱いながらも相互作用する環境応答性蛍光分子を選択した。具体的には、標的に対してライブラリー化合物をそれぞれ作用させて、標的結合に伴う蛍光強度の増加や変色が見られる化合物を決定して最適分子（ヒット化合物）とした。
ヒット化合物分子の持つカルボニル炭素に対して隣の位置（=α位）を反応起点としてBr基を導入して誘導体化したのち、人工分子との反応点であるシステインを持つライブラリーペプチド（T7ファージ上に提示させてあるもの）と、臭素化した蛍光分子とを結合させることで、ハイブリッド分子ライブラリーとした。これを磁性ビーズ上に固定化した標的蛋白質に作用させ、ファージディスプレイ法の要領にて5ラウンドのバイオパニングを行って標的結合分子を濃縮させたのち、DNAシーケンサーにて遺伝情報を解読した。このことで、ランダム化させているペプチド部分のアミノ酸配列を決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書内に述べてある、上記2段階成熟技術を確立するためのモデル実験において、標的蛋白質に対して弱いながらも相互作用する環境応答性蛍光分子(ヒット化合物)の選択、および、ファージディスプレイ法を用いた濃縮が、当初の予定通り進展しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き計画書に記載した通り、濃縮された化合物をそれぞれ化学合成し、各種NMR測定およびLC-MS/MS測定により同定したのち蛍光測定を行うことで、上記の化合物が標的以外の蛋白質には結合せず、標的蛋白質に結合する際のみに蛍光応答するかどうかを確認していく。
さらに、スズキカップリング型以外の新規環境応答性蛍光分子ライブラリーを作製し、同様の手法にて選択を行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
申請書の研究計画・方法欄に当初記載した、「Step 2. 選択された最適分子周辺ペプチドの分子進化」における⑤、⑥項を本年度行っておらず、そのための消耗品等の予算執行を行っていないため次年度使用額が生じた。先述したように、⑤、⑥項を行うためこれを速やかに執行する。
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