2018 Fiscal Year Research-status Report
Effect of chemical environment changes in cell on DNA structures and functions
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17K05941
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
建石 寿枝 甲南大学, 先端生命工学研究所, 講師 (20593495)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | DNA構造 / 擬似細胞内環境 / 転写変異 / 定量的解析 / センシング / がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA四重鎖が形成されると種々の生体反応の変異が誘発さるため、四重鎖の形成と疾患発症機構との関連性が注目されている。四重鎖の形成・解離は溶液環境の影響を受けやすいが、実際の細胞内の環境変化に応じたDNA構造を解析した例はない。本研究では、がんなどの疾患による細胞内の環境変化に注目し、細胞内の環境変化がDNAの構造と機能に及ぼす影響を知り（「知る研究」）、それらの知見を活用する（「使う研究」）。そのため、下記の3ステップに分けて研究を行う。
(a)「試験管内の擬似細胞内環境においてDNA構造を知る研究」試験管内の擬似細胞内環境下におけるDNA構造の定量的解析を行う。
(b)「細胞内のDNA構造を知る研究」擬似細胞内環境と細胞内環境において、転写産物を解析し、細胞内の四重鎖の安定性を見積もる。
(c)「細胞内でDNA構造変化を使う研究」細胞内環境下におけるDNA構造や安定性予測できるエネルギー・パラメータを基に、疾患による環境変化に応じたDNA構造変化を活用した薬剤の開発や、疾患進行を定量的に解析可能な新規のセンシングシステムの開発を行う。
本年度（2018年度）は、四重鎖の構造や安定性および四重鎖が転写反応に及ぼす影響について、試験管内の擬似細胞内環境で解析を行った。その結果、擬似細胞内環境における四重鎖の安定化機構や、転写に及ぼす影響を明らかにした。(Nucleic Acids Res, 46, 4301 (2018)など)。さらに細胞内において、四重鎖を標的とした遺伝子制御法の開発や、試験管内で活用できる疾患遺伝子の高感度センシングシステムを開発した(Molecules, 23, 2889 (2018)など)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度は、上述した(a)の研究をより詳細に遂行するとともに、(ｂ)の細胞内のDNA四重鎖の安定性を定量的に解析し、（ｃ）を目指して試験管内でDNA構造を使ったセンシングシステムの開発も行った。
まず、擬似細胞内環境においてクラウディング分子とDNA四重鎖の熱安定性及び構造を解析した。その結果、クラウディング分子は四重鎖のループ部位の塩基の構造を変化させることを明らかにした（Nucleic Acids Res, 46, 4301 (2018)）。また、立体配座の異なる天然DNA（D-DNA）の鏡像対応物としてのL-DNAは四重鎖に結合する小分子の結合性を共に解析した（Angew. Chem. Int. Ed., 57, 15723 (2018)）。さらに、これらの四重鎖の構造形成に及ぼす生体反応についても解析を行った。グアニンに富んだ鋳型DNAを用いて転写反応を行い、転写反応が四重鎖に及ぼす影響を解析した。その結果、鋳型鎖と非鋳型鎖との間の相互作用が、鋳型DNAの構造を決定し、転写効率に重要な役割を果たしていることが示された（Bull. Chem. Soc. Jpn., 92,572 (2019)）。これらの知見を基に、細胞内、擬似細胞内環境において四重鎖をもつ鋳型DNAの転写変異の産物を解析し、形成される四重鎖の構造や安定性を見積った（第45回国際核酸化学シンポジウムにて発表）。
さらに細胞内において、四重鎖を標的とした遺伝子制御法の開発や、イオンーDNAの相互作用を活用した乳がん遺伝子を高感度に検出するセンシングシステムを開発した(Molecules, 23, 2889 (2018)など)。これらの知見は、細胞のがん化を検出するDNAセンサーの分子設計にも有用である。
以上の研究成果から、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度は、(a),(b)の研究成果を集約し、(c)の開発を行う。
まず、がん関連遺伝子（c-Myc, RET, Bclなど）の四重鎖形成可能な配列周辺の転写変異を種々の細胞、擬似細胞内環境で比較し、データベース化する。特に転写変異の頻度が高い領域では安定な四重鎖が形成されていることが予測されるため、DNA配列から四重鎖の構造を解析し、転写制御に関わる重要な四重鎖構造の特性を解析する。これらの知見をもとに、細胞内環境変化に応じてDNA構造を予測する手法を開発する。
細胞のがんの発症やその進行の異なる細胞、例えば、ヒトの乳がん細胞（MCF-7）、悪性乳がん細胞（MDA-MB-231）などを用い、腫瘍の悪性化に由来する環境変化が転写変異に及ぼす影響を解析する。2018年度の成果によって四重鎖はクラウディング分子やカリウムイオンでの安定化機構が明らかになったため、試験管内でカリウム濃度を低下させた溶液に、種々の分子クラウディング剤に水の活量を変化させた環境を構築する（擬似がん細胞）。この試験管内の環境下における転写変異の解析結果と、siRNAによりカリウムチャンネル（kcnh1など）の発現をノックダウンした細胞内での転写変異の結果を比較し、転写変異を誘起するために重要な相互作用を見積もる。
さらに、細胞のがん化に応答して構造変化するDNAを用いて、正常細胞とがん細胞またはがんの進行を検出するDNAセンサーの開発を試みる。四重鎖の形成による転写変異をプローブなどで検出することにより、細胞のがん化またはその進行をセンシングし、新規の病理診断システムの開発を試みる。
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| Causes of Carryover |
執行予定の消耗品などは、すべて2018年度中に購入、納品されたが、事務手続きの都合により1件の支払い（99792円）が、2019年度に支払われる。そのため、2018年度の予算のうち99,792円を2019年に繰り越す。
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[Journal Article] An anionic phthalocyanine decreases NRAS expression by breaking down its RNA G-quadruplex2018
Author(s)
K. Kawauchi, W. Sugimoto, T. Yasui, K. Murata, K. Itoh, K. Takagi, T. Tsuruoka, K. Akamatsu, H. Tateishi-Karimata, N. Sugimoto, and D. Miyoshi
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Journal Title
Nat. Commum
Volume: 9
Pages: 2271
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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