2017 Fiscal Year Research-status Report
蛋白質間相互作用検出系FlimPIAの高感度多色細胞内検出系への発展
| Project/Area Number |
17K06920
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
大室 有紀 (松山有紀) 東京工業大学, 科学技術創成研究院化学生命科学研究所, 助教 (30571088)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 数理モデル / フォールディング / 立体障害 / 明るさ / 安定性 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
1. ルイジアナ州立大学との共同研究により、FlimPIAの数理モデルを作製しつつある。現時点の結果、アクセプタの酸化的発光反応の向上、あるいはドナーのアデニル化反応の抑制が細胞内検出に必要なことが解明されつつある。今後は、数理モデル完成後、アクセプタ・ドナーの性能の最適下を試みる。
2. FlimPIAに匹敵する性能を持つ蛋白質間相互作用検出系である3-split Nanoluc PCA (Protein-fragment Supplementation Assay)を構築した（Ohmuro-Matsuyama and Ueda, Analitycal Chemistry, 90, 3001-3004, 2018）。PCAでは、通常、酵素を2つに分断して使用するが、本系では、2つのペプチド（LcBiT, SmBiT）と残り部分（LnBiT）の3つに分断した。融合させる酵素由来の部分がペプチドサイズであることから、相互作用タンパク質の発現時におけるフォールディングの問題・立体障害の問題が解消される点が、本法の大きな長所である。相互作用タンパク質に各々LcBiT・SmBiTを融合させ、LnBiTと基質を添加すると、相互作用時に発光値が50倍以上上昇した。さらにSmBiTのアミノ酸配列を最適化することにより、肉眼で観察可能な程、シグナルが明るくなり、その発光値が１時間以上継続した。本法は、非常に注目され、Analytical Chemistryに掲載された他、2017年度日本生物工学会大会トピックスに選出され、3月13日に日経産業新聞に掲載され、2018年度蛋白質科学会にて招待講演を行う。今後、本系を細胞内検出に応用する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FlimPIAについては、数理モデルからドナー・アクセプタの改良の必要性が指摘されつつある。そのため、すぐに細胞内検出の構築は難しい。
しかし、大きな進捗として、3-split NanoLuc PCAの構築に成功したことが挙げられる。本系は、相互作用タンパク質について、発現時のフォールディングの問題や立体障害が解消される。さらにシグナル/バックグランド比が高く、また高いシグナルが長く持続する。これらの長所は、細胞内検出に適する。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. FlimPIAの数理モデルを完成させ、細胞な検出のために、アクセプタ・ドナーの性能の向上について、検討を行う。
2. 3-split NanoLuc PCAを用いて、細胞内検出を行う。
3. 1が難しい場合、2とBRETを組み合わせ、多色検出を行う。
|
| Causes of Carryover |
2017年度は、キャンペーン品等の利用により、消耗品の節約ができた。その分、2017年度に良い成果が出たので、2018年度にその成果発表をする費用としたい。
|
