2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K06922
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
神田 英輝 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (90371624)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
後藤 元信 名古屋大学, 工学研究科, 教授 (80170471)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | スキャホールド / 脱細胞化 / 抽出 / ジメチルエーテル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
液化DME（ジメチルエーテル）の供給器、抽出カラム、減圧バルブ、回収部が直列に繋がった装置を作成して、抽出カラムにブタ皮膚を充填した。25℃・0.59MPaで液化DMEを供給器から抽出カラムに流速10 ml/minで導入した。抽出カラムの内部でブタ組織に含まれる水が液化DME混合し、この混合液によってブタ皮膚から細胞表面のリン脂質が抽出される。その後、液化DMEと油脂と水の混合物が回収部で回収される。液化DMEの標準沸点は－24.8 ℃なので、減圧バルブを開放し、回収部の内部を常圧に減圧すると液化DMEは蒸発して油脂と水が得られた。抽出操作の後にブタ皮膚の残渣に、DNA分解酵素であるDNaseと4℃において1～7日間接触させた組織内部のDNAを断片化した。その後80%エタノールや水で3日間洗浄した後に、残留DNA量の定量分析を行った。
ブタ皮膚の場合には、スキャホールドの中のDNAの残存量は、DMEによる脂質抽出後(酵素処理0日目)では1622ng/mgであり、一般的なスキャホールドの目標値である50ng/mg-dryを上回った。また、ヘマトキシリン＝エオジン染色でもDNAの残留が視認された。ブタ皮膚スキャホールドを減圧雰囲気下で水で洗浄したところ、残留DMEは水で抽出除去されてGC-FIDやGC-MSで検出不可能になった。
DNase処理を4℃で行ったところ、DMEにより予め断片化したDNAが酵素と反応して、5日間の酵素処理によって残存DNAは72ng/mgとなり目標値に近くなった。
残存DNA量を更に低減するため、酵素処理を37℃に変更して再び行ったところ、ヘマトキシリン＝エオジン染色によるDNAの残留は視認できなかった。まだ、DNA残存量の定量が完了していないが、目標値である50ng/mg-dryを下回る可能性は高いと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2017年度の報告の通り、2017年度に実施したブタ大動脈に続いて、ブタ皮膚にも同手法を適用し、ブタ皮膚の場合には37℃での酵素処理が必要であることを把握できた。当初の計画よりも半年ほど早く進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度は最終年度であるので、論文執筆や成果発表を積極的に増やし、査読者や聴講者からの御指摘を踏まえた補強実験の追加を行うなどして、これまでの成果を充実させるとともに、脳などの従来技術ではスキャホールド作成が難しい部位にも挑戦したい。ただし動物の脳のハンドリングは初めての経験であり、予期せぬ困難を伴う可能性がある。
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| Causes of Carryover |
立案当初よりも実験が順調に成功したために、試行回数が少なくなるとともに、実験に従事していた学生が卒業を待たずに就職したり研究室が変わるなど、予期せぬメンバー交代があったために、論文執筆に遅れが生じた。
このため、実験に用いる消耗品と、論文執筆に関するネイティブチェックに関する費用を未使用となり、次年度にこれらを使用する。
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