2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K06924
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
勝田 知尚 神戸大学, 工学研究科, 准教授 (50335460)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヘマトコッカス プルビアリス / クロレラ ソロキニアナ / フローサイトメトリー / 熱ショック応答 / 細胞周期 / 細胞同調 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，周期的に熱ショックを与えることにより，緑藻ヘマトコッカス プルビアリスの増殖速度，ならびに最高細胞数密度が向上するという，研究代表者らが見出した新奇な増殖挙動に基づき，微細藻の増殖特性の向上を図る手法の開発を試みている．
平成 30 年度には，ヘマトコッカス プルビアリスの培養温度と照射光強度を概日周期で変化させたとき，細胞分裂が同調し，培養温度を上昇させた際に分裂するという，平成 29 年度に見出した新奇な増殖挙動を，核 DNA 量変化の観点から詳細に調べることを試みた．その結果，核 DNA 量が約 2 倍に増大する G2/M 期の細胞は 20.0℃ に保持した間に増加し、20.0℃ から 30.5℃ に切り替わるときに最も多くなり、そして 30.5℃ に保持した間に減少することが見出された。すなわち、DNA の複製は 20.0℃ に保持した間に行われ、細胞分裂は 30.5℃ に切り替わった後に行われることが核 DNA 量の変化からも確認された。さらに，30.5℃ に保持する期間を 6 h から 12 h まで延長する，あるいは一旦増殖速度が増加した細胞を継代培養すると，増殖速度の増加する時期が早まることを見出した．このことは，培養温度と照射光強度を周期的に変化することに起因する増殖速度の増加は，高温条件へ適応するための細胞の応答であることが示唆された．
さらに，緑藻クロレラ ソロキニアナにおける増殖挙動を，平成 29 年度から継続して調べた．その結果，43℃ で一定に保持すると，細胞数はほとんど増加せず，その一方で細胞径は顕著に増大したことから，クロレラ ソロキニアナの細胞分裂に関与する因子は 43℃ 付近で不活化すること，しかしこの不活化による増殖阻害は，周期的に培養温度を 37℃ 以下に低下すると回避できることを見出した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成 30 年度には，細胞分裂が同調し，培養温度を上昇させた際に細胞分裂が行われるという，平成 29 年度に見出した新奇な増殖挙動を核 DNA 量変化の観点からも確認した．核 DNA 量変化をフローサイトメトリーにより追跡するために，はじめにヘマトコッカス プルビアリスの細胞壁を壊し，細胞内から核を抽出するための条件を検討した．ヘマトコッカス プルビアリスの栄養細胞の細胞壁には構成成分としてタンパク質が 75% も含まれていること [Hagen, C., et al., Eur. J. Phycol., 37, 217-226 (2002)] から，タンパク質分解酵素の一種，ブロメラインを用いてヘマトコッカス プルビアリスの栄養細胞の細胞壁を除去できることを見出した．これによって，ヘマトコッカス プルビアリスの核 DNA 量変化を追跡することができた．
また平成 30 年度には，エレクトロポレーション遺伝子導入装置を設備備品として購入するため，ネッパジーン社 (市川市) が開発した新方式の選定を行い，最終的に Pro-Vitro-S を購入した．この装置では，細胞に穿孔するときと細胞内へ DNA を移動させるときとで，個別にパルス条件を設定することができる．一方，小型バブルカラム式フォトバイオリアクターについては，2 台の解放回路用チラーとタイマー式スイッチからなる恒温槽を増設し，さらにエアコンプレッサーとガス流量計を整備して，CO2 濃度を調整した空気の供給を飛躍的に精度よく行えるようにした．
以上のように，平成 30 年度には研究に支障は生じておらず，おおむね順調に進展していると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の目的は，研究代表者らが見出した，緑藻ヘマトコッカス プルビアリスの増殖速度と最高細胞数密度が概日周期で培養温度と光強度を適切な範囲で変化させると従来の最適条件で得られるレベルよりもさらに向上するという新奇な増殖挙動について，その分子メカニズムの解明を試みるとともに，これを応用して他の微細藻の増殖特性の向上を図ることにある．これまでの研究で，ヘマトコッカス プルビアリスの培養温度と照射光強度を概日周期で変化させたとき，細胞分裂が同調し，培養温度を上昇させた際に分裂が起こるとともに，G2/M 期の細胞が最も多くなることを見出した．また，ヘマトコッカス プルビアリスの栄養細胞の細胞壁を除去する手法も確立することができた．平成 31 年度には，これらの検討を通して得られた知見に基づき，エレクトロポレーション遺伝子導入装置を用いて細胞内へ外来遺伝子を導入する際に適切な細胞周期を選択する検討を行い，微細藻の形質転換の効率化を図りつつ，増殖特性の向上を図るための検討を行う予定である．
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| Causes of Carryover |
平成 30 年度には，9 月に鹿児島大学で開催された化学工学会第 50 回秋季大会に 2 名の研究協力者とともに出席した．このとき，研究協力者分の旅費を校費より拠出したため，旅費の支出が予定よりも大幅に抑制された．一方，設備備品のエレクトロポレーション遺伝子導入装置を購入するため昨年度に購入を抑制していた消耗品は，今年度，予定通りに購入した．こうして生じた次年度使用分は，平成 31 年度に購入予定の消耗品の予備に充てる予定である．
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