2017 Fiscal Year Research-status Report
High through-put generation of thermostable enzymes in thermophile cells
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17K06925
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
鈴木 宏和 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (80462696)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ジオバチラス / スクリーニング / 好熱菌 / 耐熱化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
好熱菌内で発生した耐熱化変異酵素を，活性に依存することなく選別する3つの手法（蛍光レポーター直列法，蛍光レポーター直列法改，および蛍光レポーター融合法）を設計した。BSpyrFAやSpyrFVをモデルにしながら，上述した3手法の有効性を評価した。
BSpyrFAおよびBSpyrFV遺伝子の下流にvenusを配置した各レポータープラスミドを構築し，好熱菌に導入した。形質転換体を50℃で培養し，細胞蛍光強度を測定した。蛍光レポーター直列法では，比較的強い細胞蛍光強度が得られたが，上流遺伝子の相違すなわちBSpyrFAとBSpyrFVの耐熱性の相違と細胞蛍光強度の間に相関性は見られなかった。蛍光レポーター融合法では，全体的に蛍光値は低く，細胞蛍光強度もほとんど変化しなかった。蛍光レポーター直列法改では，BSpyrFVを配置した場合のほうがBSpyrFAを配置した場合よりも細胞蛍光強度が強かったが，例外もあった。蛍光レポーター直列法改については，培養温度が55℃と60℃の場合も調べたが，この場合も上流遺伝子の相違と細胞蛍光強度の間に相関性はなかった。
好熱菌が変性タンパク質の蓄積によって発現変動させる遺伝子を，RNAシークエンス（RNAseq）を用いて解析した。それら遺伝子の挙動を確認するために，そのプロモーター領域と黄色蛍光タンパク質（Venus）の遺伝子を連結したレポーターカセットをHTA426派生株の染色体に導入した。得られたレポーター株のVenusシグナルは，変性タンパク質の有無に関わらず弱く，プロモーターの挙動は把握できなかった。そこでプラスミドを用いても検証したが，RNAseqの結果とは矛盾する結果が得られた。その理由として，Venusが高温下では成熟しにくく，変性タンパク質として蓄積してしまうためと考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
デザインした手法の検証がおおむね完了した。変性タンパク質に応答するであろう遺伝子も見出すことができた。これは当初計画において期待したとおりの研究成果であるため，研究進捗は順調と判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
変性タンパク質に応答する遺伝子の分析を進める。レポーター遺伝子は黄色蛍光タンパク質遺伝子ではなく，近年，高温で機能しやすいと報告されたスーパーフォールド緑色蛍光タンパク質遺伝子もしくは耐熱性ガラクトシダーゼ遺伝子を使用する。また，平成29年度の研究過程で，変性タンパク質が蓄積すると生育速度が変化する培地条件を偶然に見出した。平成30年度では，この培地条件が他の変性タンパク質蓄積においても生育速度に影響するかを詳細に調べていく。そのために，複数の枯草菌タンパク質をモデル酵素に加える。それらの発現系を構築し，組換えタンパク質を生産し，その耐熱性を評価する。並行して，それら遺伝子を好熱菌でも発現させ，それが好熱菌の生育に及ぼす影響を評価していく。
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| Causes of Carryover |
2月に実施したFACS解析の費用をゆとりをもって残しておく必要があったため，その分のゆとり繰越金がわずかに生じた。次年度に消耗品費として使用する。
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