2018 Fiscal Year Research-status Report
High through-put generation of thermostable enzymes in thermophile cells
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17K06925
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
鈴木 宏和 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (80462696)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ジオバチラス / スクリーニング / 好熱菌 / 耐熱化酵素 / 生育阻害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
好熱菌内で発生した耐熱化変異酵素を，活性に依存することなく選別する手法（蛍光レポーター法や変性タンパク質レポーター法）を設計した。非耐熱化酵素のBSpyrFAやその耐熱化変異酵素BSpyrFVをモデルにしながら，本年度では変性タンパク質レポーター法と，新たに設計した変性タンパク質生育阻害法を検討した。
前年度の研究から，変性タンパク質の蓄積によって発現変動させる好熱菌遺伝子を見出した。本年度では，そのプロモーター領域に耐熱性ガラクトシダーゼの遺伝子を配置し，好熱菌の染色体に導入した。得られたレポーター株にBSpyrFVやBSpyrFA遺伝子の高発現プラスミドを導入し，様々な温度で培養後，ガラクトシダーゼ活性を測定した。本実験は，3つの候補プロモーター（プロモーターA，B，およびC）について行った。AとBに基づくレポーターでは，BSpyrFVとBSpyrFAの生産によるガラクトシダーゼ生産量に差異は見られなかった。Cに基づくレポーターでは，ガラクトシダーゼ生産量に明確な差異があったが，培養温度による変化が少なく，また活性を欠失させた変異体の生産においては差異がほとんどなかった。よって上述した差異は，BSpyrFの耐熱性に起因したものではなく，BSpyrFの活性に応答した可能性も考えられる。
変性タンパク質生育阻害法も検討した。好熱菌にBSpyrFVやBSpyrFA遺伝子の高発現プラスミドを導入し，それらの生育パターンを解析した。その結果，BSpyrFVを高発現させた株は，BSpyrFAを高発現させた株よりも早く生育することがわかった。変異体の生産についても同様な結果が得られた。生育の遅延は変性タンパク質の蓄積が生育を阻害したためと考えられ，極めてシンプルな耐熱化スクリーニング法につながる可能性をもっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
変性タンパク質レポーター法の検証がおおむね完了した。加えて変性タンパク質生育阻害法も検証し，その有効性を見出した。当初の計画からはわずかな変化があったが，目的達成のための進歩があった。総じて研究進捗は順調と判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成31年度は，変性タンパク質生育阻害法の解析を進める。解析に時間がかかるため，モデル実験に半年以上費やす見込みである。それにより有効性が確認できた場合には，さらに様々なタンパク質を生産させ，生育パターンに対する影響を評価する。また最終的な応用（ランダム変異ライブラリーからの耐熱化変異体のスクリーニング）を考えた場合，現在使用している好熱菌は形質転換効率が悪いためライブラリー化が難しい。そこで31年度では並行して，電気穿孔法で効率よくDNAを導入できる好熱菌を獲得する。そして本好熱菌においても変性タンパク質生育阻害法が有効であるかを確認する。
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| Causes of Carryover |
平成２９年度からの繰越金が残存したため。平成３１年度の消耗品の購入に使用する計画である。
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