2018 Fiscal Year Research-status Report
iPS細胞由来内胚葉前駆細胞の大量創出と肝再生医療への応用に関する基盤研究
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17K06928
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
水本 博 九州大学, 工学研究院, 准教授 (90346817)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 分化誘導培養 / 三次元培養 / iPS細胞 / 細胞運命制御 / 中空糸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①中空糸内三次元分化培養における中空糸径効果：前年度に引き続き、中空糸内三次元培養条件下におけるヒトiPS細胞の分化誘導における中空糸径効果について検討を行った。まず、内径の異なる2種類の中空糸にiPS細胞を充填し、自発的分化誘導条件下において10日間の培養を行った。培養10日目において三胚葉における代表的な遺伝子マーカーの発現を評価した結果、内径の大きな中空糸では中胚葉系マーカーの発現が、また内径の小さな中空糸では外胚葉系マーカーの発現が高いことが示された。一方、内胚葉分化においては、中胚葉、外胚葉と比較して中空糸径の影響は観察されなかった。
次に、内胚葉系分化誘導において、Activin Aを培養培地に添加し、増殖因子の添加効果について検討を行った。その結果、内胚葉マーカーであるSOX17は内径の小さな中空糸において高い発現が認められた。これは、Activin Aが濃度依存的に細胞の分化を誘導するため、内径の小さな中空糸の方が有効濃度の範囲が相対的に大きかったためであると考えられる。
以上の結果、中空糸径はiPS細胞の分化に影響を与え、標的細胞や分化誘導法に応じて適切な中空糸を用いることが効率的な分化誘導プロセス構築において重要であることが示された。
②中空糸内三次元培養によるヒトiPS細胞の肝分化誘導：中空糸内に充填したヒトiPS細胞に対し、Activin A、HGF、オンコスタチンMを段階的に添加することにより肝分化誘導を行った。分化誘導15日目の細胞は肝特異的機能であるアンモニア除去能、アルブミン分泌能の発現を認めた。この結果、機能的な肝細胞が中空糸内部において分化誘導されていることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の検討において、中空糸径がヒトiPS細胞の分化の方向性を決める一つの要因になることが示された。具体的には、外胚葉分化においては径の大きな中空糸を、また中胚葉分化においては径の小さな中空糸を用いることが有効である可能性が示唆された。内胚葉分化に対しては中空糸径は明確な影響を示さなかったが、これらの結果は標的細胞に応じて適切な中空糸を用いることが効率的な分化誘導プロセス構築において重要であることを示唆している。さらに、分化誘導因子であるActivin Aを添加した内胚葉分化誘導条件においては、内径の小さな中空糸においてより効率的な内胚葉分化が達成された。この結果は、濃度依存で効果を示す分化誘導因子を用いる場合、三次元細胞組織体内部での濃度分布を考慮することにより効率的な分化誘導が可能となることを示唆している。以上の結果、iPS細胞の効率的な内胚葉分化のためには、少なくとも分化誘導初期段階においては中空糸径の小口径化が有効であることが見出された。
また、平行して実施した中空糸内三次元培養によるヒトiPS細胞の肝分化誘導において、主要な肝機能であるアンモニア除去能とアルブミン分泌能の発現を確認した。上記の中空糸径の最適化と組み合わせることにより分化誘導率の向上が期待できる。
一方、分化細胞による組織構築の準備として、特筆すべき成果は得られていないが、初代細胞を用いた組織構築に関する検討を行っており、その検討で得られた条件を今後利用する予定である。
以上の結果、本研究はおおむね順調に進行していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
内胚葉前駆細胞の創出プロセス構築としては、本年度の検討を基に中空糸径による分化誘導プロセスの最適化を行う。一方、本研究では内胚葉分化をターゲットとしているが、中胚葉分化、外胚葉分化において中空糸径が大きく効果を示す可能性も示された。従って、これらの胚葉への分化をターゲットとした分化誘導プロセスへの展開の可能性も検討する必要があると考えられる。具体的には、心筋細胞、神経細胞をターゲットとした分化誘導プロセスへの展開に関する検討に着手する予定である。
一方、iPS由来細胞を用いた肝組織構築については、当初の予定通り、分化誘導過程における細胞を分離取得し、組織構築を試みる。分取した分化細胞を用いてスフェロイドを作製し、中空糸内部に充填することによって再組織化を行うボトムアップ法による組織構築を実施する。この検討において、内皮細胞の添加、また増殖因子固定化基材の添加について検討を行い、その効果を明らかにすることにより組織構築条件の確立を目指す。
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