2017 Fiscal Year Research-status Report
バイオ燃料電池に有益な機能を高度に集約した燃料電池用スーパー大腸菌の開発
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17K06932
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
東 雅之 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (20285282)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾島 由紘 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 講師 (20546957)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 微生物燃料電池 / バイオ燃料電池 / 微生物触媒 / MFC / 代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バイオ燃料電池に有益な機能を集約した大腸菌の開発から、燃料電池の出力向上に取り組んだ。過去に開発した大腸菌では、染色体上の破壊したい遺伝子を、過剰発現プロモーター下の導入遺伝子により破壊していた。そのため、効果が見られても、遺伝子破壊と過剰発現のどちらの効果か明確でないケースが見られた。また、過剰発現についてリアルタイムPCRを用いて解析をしたが、期待したほどの発現上昇が見られないケースも見られた。そこで、過剰発現する遺伝子の数はできるだけ少なくすることにし、まずは遺伝子破壊を集約した株を構築してからそこに過剰発現を加える方針とした。
計画では、ピルビン酸からの代謝の分岐を抑制し、TCAサイクルへの流れを促進し、さらにNADHからの電子伝達への流れを補強することを目的としていた。そのため、TCAサイクルの逆回転を抑制する目的でfrdA遺伝子を破壊し、その株に出力もしくはクーロン効率が向上する遺伝子破壊を次々に重ねた。TCAサイクルへの入口となる反応を抑制するpdhR遺伝子、ピルビン酸から乳酸への分岐を触媒するldhA遺伝子、エタノールへの分岐に関連するadhE遺伝子、酢酸への分岐に関連するpta遺伝子を破壊した5重破壊株を構築した。この株ではこれまで大腸菌を用いて検討した中で最も高い出力を示し（野生株の約1.5倍）、クーロン効率も20%に近い値（野生株の約3倍）を示した。また、有機酸蓄積をHPLCで解析した結果、乳酸の蓄積はほとんどなく、酢酸はフマル酸と予想されるピークが増加することによって正確な測定はできなかったが、それほど多くは含まれていないと推察された。一方、ピルビン酸は野生株より多く蓄積していた。乳酸などへの分岐を抑制した場合、frdAやpdhR遺伝子の破壊では不十分と考えられ、その他のTCAサイクル抑制に関わる遺伝子の破壊を重ねることで課題解決に取り組んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの検討から効果が期待される遺伝子を選び、5種類の遺伝子の破壊を重ねることに成功した。その結果、出力とクーロン効率がともに向上した株を構築でき、とくに総出力での評価では、遺伝子破壊の重ね合わせだけでこれまでの最高値を得ることができた。また、有機酸の解析から構築株を用いて今後検討すべき課題も明確となった。一方で、目的遺伝子の過剰発現の検討については、種々の検討結果からその数をしぼり、遺伝子破壊の集約後に検討する方針とした。検討しようと考えている遺伝子のほとんどの発現プラスミドはすでに保有しているため、この点でもそれほど遅れてはおらず、おおむね順調と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
H29年度からの引き続いての課題は、5重破壊株を用いて発電した時のピルビン酸蓄積の解消と、電子伝達系での改変となる。前者はすでに検討を進めており、TCAサイクルを抑制すると考えられているarcAとarcB遺伝子の破壊を重ね、TCAサイクルへの代謝の流れを改善する。また、新たな遺伝子の導入や過剰発現系からの改善については大旨遺伝子破壊の重ね合わせが終了してから検討する。後者については、構築した多重破壊株にndh遺伝子を過剰発現させることによってその改変を進める。発現量が少ないと判断した場合は、複数箇所への導入を検討する。これらにより、H29年度に示した出力とクーロン効率がさらに向上することが期待される。
また、H30年度からの新たな検討として、細胞膜での電子伝達系から電極への電子伝達機構の改善に取り組む。具体的には、他種微生物の細胞外電子伝達系を大腸菌に導入することや、電極へのバイオフィルムの形成などによってその改善に取り組む。これらにより、使用しているメディエーターの量を減じることが可能になることが期待される。さらに、燃料の取り込みや燃料の種類についても検討を開始する。具体的には、ピルビン酸の蓄積等が解決されることを前提に、燃料となるグルコースの細胞内への取り込み能力を改善し出力向上を目指す。加えて、キシロースからの発電が可能となるように改変する。これにより、木質バイオマスのようなグルコースとキシロース混合液からの効率的な発電も期待される。
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| Causes of Carryover |
購入予定であった恒温振とう培養機（55万円相当）は別の装置を代用することが可能となり購入を見送った。また、予定外であったが旅費やその他でおおよそ52万円分を支出した。H29年度に結果として残った約15.5万円は、H30年度の物品費（消耗品）が当初計画だけでは不足すると予想されたため、消耗品費で使用予定とした。
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