2017 Fiscal Year Research-status Report

Physiological role of vesicular glutamate release from glial cells

Research Project

Project/Area Number	17K07070
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	宮下知之公益財団法人東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 主席研究員 (70270668)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	グルタミン酸 / グリア細胞 / 学習 / 記憶 / ショウジョウバエ / vGluT / 開口放出
Outline of Annual Research Achievements	ショウジョウバエを用いた罰を無条件刺激とする連合学習において、罰として使用される電気ショックの情報は、条件刺激である匂い情報とキノコ体で連合する。条件刺激である匂いの情報は、匂い神経から、1次中枢であるantennal lobeを経てキノコ体に伝えられるが、無条件刺激である電気ショックの情報はどのようにキノコ体に伝えられているかは未だに不明である。一方最近我々は、ショウジョウバエのグリア細胞の1種であるEnsheathingグリアに特異的に発現する新規のvGluT、DvGluT2を同定した。近年、グルタミン酸（Glu）は神経細胞からだけでなくグリア細胞からも神経伝達物質として放出されていると考えられるようになってきた。2004年、初代培養グリア細胞を用いた研究からvGluTが神経細胞だけでなくグリア細胞にも発現し、Glu放出を担っていることが報告されたが（Montana et al., J. Neurosci., 2004）、vGluTがグリア細胞に存在する証拠はないとする報告も有り、グリア細胞によるGlu放出に関しては、その分子的な実体も生理的な意義についても未だ不明のままである。そこで、RNAiを用いてDvGluT2をグリア細胞でKnock downすると、匂いと電気ショックを用いた連合学習が障害され、DvGluT2がグリア細胞内で機能している事が示唆された。さらに、活動依存的なシナプス伝達の痕跡の可視化法を利用して、キノコ体とEnsheathingグリアとの間で、どの様なタイミングで開口放出が起こっているかを調べた。その結果、驚いたことに、匂いと電気ショックを同時に与えた時だけでなく、電気ショックのみを与えた時でも開口放出の痕跡が検出された。このことからEnsheathing グリアからのGlu放出が、電気ショックの情報をキノコ体に伝えている可能性が考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ショウジョウバエで、グリア細胞に発現が示唆される新規の小胞型グルタミン酸トランスポーター(vGluT)を同定し、Drosophila vGluT2(DvGluT2)と名付けた。DvGluT2の抗体を作成し、免疫染色を行うと、ショウジョウバエで同定されているグリア細胞の内、Ensheathing gliaとよばれるグリア細胞にDvGluT2が発現している事を見出した。そこで、成虫の神経細胞やグリア細胞でDvGluT2をノックダウンしたところ、学習に強い障害が現れた。このことからDvGluT2は学習に重要な機能を持っていることが示唆された。そこで、実際にグリア細胞からグルタミン酸が開口放出されているのかを調べるために、開口放出の痕跡を可視化することができる機能的GRASP法をおこなった。匂いと電気ショックを用いた連合学習時に、学習記憶の中枢であるキノコ体を取り囲むEnsheathig gliaから、キノコ体への開口放出があるかを調べたところ、キノコ体上に開口放出の痕跡が現れた。驚いたことに匂いでは痕跡が現れなかったが、電気ショックのみで開口放出の痕跡が現れた。このことからEnsheathing gliaからのグルタミン酸放出は、キノコ体に電気ショックの情報を伝えている可能性が考えられた。
Strategy for Future Research Activity	Ensheathing gliaからの開口放出が電気ショックの情報を伝えている可能性が考えられたので、生きたショウジョウバエに匂いや電気ショックを与えながら、特定の細胞内シグナルの動態を調べることができるin vivoのイメージングを行う。Ensheathingグリアに発現させたDvGluT2::pHluorinを用いたimagingでは、電気ショックに合わせて開口放出を示す蛍光の変化が観察されたが、これが本当にGluを放出しているのか？　また、どのようにキノコ体に伝わり、匂い情報と連合されるのか?を、GluのセンサーであるiGlusnFRや、 [Ca2+]iの変化を観察できるG-CaMP、膜電位の変化を観察できるLOTUS-Vなどを発現させたショウジョウバエを用い明らかにしていく。
Causes of Carryover	物品費の出費が当初の計画より安く抑えることができたため。残金は、Lotus-vを発現するtransgenic flyの作成とimaging時に必要なアンタゴニスト等の購入に使用する。