2017 Fiscal Year Research-status Report
中脳をモデル系とした新規神経細胞発生及び移動様式の解明
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17K07071
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| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
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Principal Investigator |
有村 奈利子 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, その他部局等, 外来研究員 (20420375)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 中脳神経 / 細胞移動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、「多様に分化した神経細胞がいかにして個々の機能すべき場所に移動し、停止するか」を、進化の最初期に発達する中脳をモデル系として、現象論からその分子機構まで明らかにすることである。私は先行研究にて、(1)膜分子DscamとRapGEF2/Rap1が神経細胞移動開始のスイッチとして機能すること、(2)早期発生神経軸索が後期神経細胞移動をトリガーする可能性、(3)新規の神経細胞移動様式、を見いだした。中脳神経細胞を解析する事で、新規且つ普遍的な神経細胞移動の仕組みを理解できると考えられた。本研究では(I) タイムラプス観察による中脳神経細胞の「多様な」移動様式の解明、(II)「同時期同領域」で多様に分化する中脳細胞の遺伝子発現解析、(III)(2)で上述した「トリガー説」の更なる検証、を通して、上記命題を明らかにする。当該年度の研究実績としては、タイムラプス観察による中脳神経細胞の多様な移動様式を解析するために、興奮性または抑制性神経細胞のCrispr-Casによる細胞ラベルを行なった。興奮性神経細胞の可視化のために、vGluT2下流にEGFPを繋げるゲノム編集plasmidを作成した。また、抑制性細胞にはGAD67にEGFPを繋げるゲノム編集plasmidを作成した。まずは培養細胞へのelectropolationにて、EGFPを確認し、またin utero electropolationにてもEGFPの蛍光ラベルされた神経細胞を確認した。ただし、そのゲノム編集効率が低いことから、現在方法の改良を試みるに至った。また、多様に分化する中脳細胞の遺伝子発現解析としては、まずは、他の領域で知られているマーカー分子の発現パターンを網羅的に解析した。そして新たな中脳神経細胞の分裂、分化様式を提案した。この解析結果は現在論文投稿準備中であり、今後の遺伝子解析に繋げてゆきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該研究分野における最大の難点は、中脳神経細胞発生時におけるマーカー分子の不在である。したがって私は、まず他の領域で知られている伝統的な分子マーカーを利用して中脳発生における各種細胞の分布をその細胞分裂や成熟の程度などを指標に詳細に調べた。その結果、中脳神経細胞は、先によく知られている大脳皮質や小脳などとは異なり、脳室面でのみ分裂、分化した後に、前駆体マーカー分子（通常は分化前に発現する）を発現することを見出した。これらの研究成果は、現在論文投稿準備中であり、当該研究の発生期中脳神経細胞の分類という目標に大きく前進するものと考えている。したがって、本研究課題は大きく目標に向かって進展していると考えている。さらに、Crispr-Casシステムを用いた神経細胞のラベルについても、未だ報告の少ない培養細胞系でのゲノム編集技術の立ち上げに成功しており、この点も本研究が順調に進展していると考えた所以である。
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| Strategy for Future Research Activity |
同時期同領域で多様に分化する中脳神経の遺伝子発現解析について特に研究を推進する。特に個々の神経細胞のトランスクリプトーム解析と細胞(種)間比較を行う。まずは、「神経幹細胞」を対象に個々の細胞のトランスクリプトーム解析をおこなう。中脳神経細胞は胎生期(E)9.5から15.5までの間に分化する。この期間に子宮内電気穿孔法により蛍光遺伝子を胎児中脳の脳室面に導入する。これにより胎児脳の分裂中の神経幹細胞をラベルする事ができる。レーザーマイクロダイセクションを用いて、RNAを増幅、回収する。それらを マイクロアレイもしくはRNAseq(理研GeNAS)にかけて、RNAのトランスクリプトーム解析を行う。得られた個々の遺伝子発現量データを用いて細胞(種)間比較を行い、既知の遺伝子発現をベースに細胞種を同定、分類する。また、移動細胞や停止後の神経細胞についても同様の研究を行う。これら一連の解析結果を詳細に比較、解析することにより、機能的神経細胞の遺伝子発現変化の全体像を解明する。さらに、「移動細胞」の、細胞移動や停止に関わる機能分子(誘因、反発因子などの受容体や細胞移動に関わる因子等)で特徴的発現をするものをスクリーニングし、細胞移動と停止に関わる分子が細胞(種)間でいかに異なるかを明らかにする。次に、中脳神経細胞のマーカー分子の確立を行う。上記で同定した、各細胞で特徴的に発現する遺伝子について、免疫染色等を行い、特定の発生段階で特定の領域にのみ発現する因子をマーカー分子として同定する。これら分子の機能解析を(II)-(2)にて行う。本研究により、中脳神経細胞の発生と機能的分化を包括的に解明する事が期待できる。
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| Causes of Carryover |
初年度と次年度にまたがる形で計画していたトランスクリプトーム解析（外部発注を計画）の金額を次年度に持ちこちしてる。現在実験および解析は進行中であるが、外部発注による解析と支払いを未だ行なっていないため、次年度に繰り越す必要性があった。
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Research Products
(7 results)
