BRAG2-Arf6シグナル経路による新たなシナプス可塑性制御機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07082
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 深谷 昌弘 北里大学, 医学部, 講師 (10360900)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: AMPA受容体 / シナプス可塑性 / Arf6 / BRAG2

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、酵母ツーハイブリッドスクリーニングで新たにBRAG2と結合することが判明したPSD-95とendophilin 3に着目し、BRAG2のPSDでの局在制御機構を解明すると共に、BRAG2-Arf6シグナル経路を介した興奮性シナプスのシナプス可塑性の一つである長期抑圧(LTD)におけるAMPA型グルタミン酸受容体の輸送調節機構を解剖学および生化学的手法やライブセルイメージング手法を用いて解明することを目的として研究を遂行している。これまでの解析から、BRAG2とPSD-95の培養海馬神経細胞での強制発現解析によってPSDにおけるBRAG2のC末端領域とPSD-95のPDZドメインとの相互作用による局在制御機構を明らかにすると共に、BRAG2のプロリンリッチ領域とendophilin 3のSH3が相互作用に重要であることを明らかにした。また、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時のBRAG2ノックダウン法によるAMPA受容体のシナプス表面発現量変化の解析を行い、BRAG2がノックダウンされているとmGluR刺激によって誘導されるAMPA受容体のシナプス表面発現量の減少が抑制され、BRAG2のshRNA耐性ミュータントによる機能回復実験も成功した。さらに、培養神経細胞での解析からmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時にBRAG2とendophilin 3との結合量が増加すること、それに伴ってArf6の活性化が上昇することを明らかにした。これらのことから興奮性シナプス後部においてBRAG2がendophilin3との相互作用を介してシナプス可塑性を調節することが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2018年度以降は、2017年度から継続している解析と新たにシナプス可塑性誘導に伴った活性化Arf6の量的な変化とBRAG2とendophilin3との相互作用の変化の解析を行う研究計画で解析を進めてきたところ、予定通りの進捗で結果が得られている。具体的には、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時のBRAG2ノックダウン法によるAMPA受容体のシナプス表面発現量変化の解析を行い、BRAG2がノックダウンされているとmGluR刺激によって誘導されるAMPA受容体のシナプス表面発現量の減少が抑制され、BRAG2のshRNA耐性ミュータントによる機能回復実験やendophilin3およびPSD-95との相互作用部位を欠損させたミュータントによる実験でBRAG2とendophilin3との相互作用のAMPA受容体の表面発現量調節における重要性を明らかにした。さらに、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時にBRAG2とendophilin 3との結合量が増加すること、それに伴ってArf6の活性化が上昇することを明らかにした。これらの結果から、ほぼ研究計画の予定通りに研究が進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

2018年度までの解析結果を踏まえ、研究計画に沿って以下の解析を進める予定である。海馬培養神経細胞のDHPG処理によるシナプス可塑性誘導時にBRAG2分子がスパイン内部もしくは樹状突起内部においてダイナミックに移動しているかどうかを検証するためにEGFP標識したBRAG2もしくはPSD-95を発現させた海馬培養神経細胞のライブセルイメージングを行う。ライブセルイメージングでは倒立型共焦点レーザー顕微鏡のステージに温度、酸素および二酸化炭素濃度を一定に保つ培養装置を装着させてイメージングを行い、DHPG添加によってLTDを誘導した後に経時的にイメージングを行う。LTDの誘導に伴ってBRAG2およびPSD-95のスパインおよび樹状突起内部での蛍光強度の変化を定量するとともにmCherryで細胞全体を可視化させておいてスパインの大きさや形の動態も観察する予定である。これらの解析からBRAG2-Arf6シグナル経路の分子ネットワークの変化とスパインの動態を同時に観察することでBRAG2-Arf6シグナル経路のシナプス可塑性発現時の機能的役割の一端を解明できると考えている。

Causes of Carryover

2018年度には効率よく解析を遂行できた。そのため使用予定であったシナプス可塑性誘導用の試薬の量が少量で済んだことから77,760円の次年度使用額が生じた。2019年度は研究計画通りにライブイメージングを行い、多くの試薬の消費を予定しているため、次年度使用額はライブイメージング用試薬に充当する予定である。