2017 Fiscal Year Research-status Report
iPS細胞を用いたGFPT1先天性筋無力症の病態解析および治療研究
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17K07094
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
伊藤 美佳子 名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (60444402)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大河原 美静 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80589606)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 先天性筋無力症候群 / 神経筋接合部 / GFPT1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先天性筋無力症候群(congenital myasthenic syndromes, CMS)は神経筋接合部(neuro muscular junction, NMJ)に発現するタンパクをコードする遺伝子の先天的分子欠損症により神経筋伝達障害が起こる疾患群である。NMJ で機能する分子のうちCMS の原因として知られている分子は、骨格筋アセチルコリンレセプター(AChR)、Collagen Q、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、Rapsin、MuSK、LRP4、GFPT1、DOK7,Agrin 等が挙げられる。CMS の原因分子の一つに、タンパクや脂質の糖化酵素であるGFPT1(Glutamine:Fructose-6-Phosphate Transaminase 1)の変異があり、肢帯型の筋力低下が特徴である。GFPT1は広範囲に発現するタンパクであり、なぜNMJに限定してCMS症状を起こすのかは不明である。
当該年度において、GFPT1遺伝子のc.252A>T と c.722^723insG のヘテロ変異を持つ患者を同定した。c.252A>T (pE84D)変異はexon4のskipするスプライシング変異であった。c.722^723insGはalternatively spliced (muscle and heart specific) exon 9内の変異であり、reading frameを変えてpremature stop codonをexon 10内に導く。この患者由来のiPS細胞を使用し、MyoD expression systemを用いて筋細胞に分化させることができるiMyoblasts (iMbs)に発展させた。コントロールと患者由来のiMbsはDoxycycline添加後6日でmyotubeに分化した。100 mM N-Acetylglucosamine (GlcNAc)を培地中に添加するとiMbsの分化効率は上昇し、一方、GFPT1遺伝子のexon9のalternatively splicingはinclusionになり、c.722^723insGによる病態を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
患者変異GFPT1遺伝子の解析においてin vitroでの解析は順調に進んでいる。次年度に向けて、変異マウスを用いたin vivo実験は、マウスを準備するのに時間がかかるため、同時並行でGFPT1のノックインマウスの作製を行った。次年度に実験に用いる引数と週齢になるよう、現在、マウスを繁殖させている。
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| Strategy for Future Research Activity |
GFPT1-CMSの分子メカニズムを解明と、この変異の表現型を解析するため、NMJで特異的に発現しているacetylcholine receptor (AChR), MuSK, LRP4, collagen Q, agrin, dystroglycanなどの細胞外もしくは細胞膜結合タンパクのglycosylationレベルを、筋分化させたiMbsおよびノックインマウスを用いて調査する予定である。
in vitro実験では筋分化させたiMbsにおいてAChR のクラスター形成能やMuSKのリン酸化レベルを定量する。
in vivo実験では、作製した患者変異を有するGFPT1のノックインマウスの運動試験・行動量試験などの表現型の解析や、NMJ特異的に発現している分子の変化を検出し、患者変異GFPT1において、異常を起こした分子メカニズムを解明する。さらに、治療戦略として、この変異の表現型を回復させる薬剤の選別や、アンチセンスオリゴを用いた治療法についても検討する。
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| Causes of Carryover |
患者変異を有したノックインマウス２種類を外部受託(60万円x2)で作製する予定であったが、学内の改変動物作製のトライアルが始まり、動物実験施設技術支援により２種のノックインマウスの作製に成功したため、未使用分が生じた。
次年度は実験に必要な細胞培養機材、試薬、プラスティックディスポ器具、マウス飼育費が必要であり、未使用分はこれらの費用に充てる。また、学会での発表や情報収集のための参加費・旅費が必要である。
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Research Products
(5 results)
