2018 Fiscal Year Research-status Report
オリゴデンドロサイト変性過程に関与するマイクロRNAの解析
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17K07099
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
久原 真 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (80336403)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀尾 嘉幸 札幌医科大学, 医学部, 教授 (30181530)
下濱 俊 札幌医科大学, 医学部, 教授 (60235687)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | オリゴデンドロサイト / 変性 / マイクロRNA / 初代培養 / 多発性硬化症 / SIRTファミリー / 分化 / 前駆細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞機能を恒常的に維持するために様々な分子の発現を制御する内在的マイクロRNA(miRNA)が近年同定され、これらは細胞に負荷されるストレスに対して一時的に発現が変化するのだけではなくさまざまな神経変性疾患において長期間にわたり作用することも明らかになっている。我々が関心を持つ中枢神経脱髄疾患である多発性硬化症(MS)は免疫異常により中枢神経に炎症が生じることが病態の中心と考えられてきたが、近年髄鞘ミエリン産生細胞であるオリゴデンドロサイト(OLG)を障害する変性疾患の特徴を有することも次第に明らかになってきている。そこでMSの病態機序を変性疾患と捉えその病態に関与するOLGにおいて変化しうるmiRNAの同定並びにその機能をin vitroないしin vivoの系で明らかにし治療戦略に供することを目的として申請したものである。
このためにマウス初代培養によるOLG前駆細胞(OPC)からOLG細胞へ分化させる系を用いる。分化前のOPC, 分化条件で培養中のOPC, 成熟したOLGを回収してtotal RNAを取り出してmiRNA array解析でコントロール条件の結果と比較することで網羅的に発現が上昇ないし低下したmiRNA候補を探索することを計画していた。これら発現制御によってOPCの分化の効率を免疫細胞染色やウェスタンブロットでA2B5、O4、O1などの未分化細胞マーカー、CNPase、MBPなどの成熟細胞マー
カーの発現の変化を観察する。
現在マウス胎仔脳からOLG前駆細胞を取り出す手順については概ね確立しているが、有意差のあるmiRNAの発現の比較が困難である。そこで初代培養や細胞株を用いて、SIRTファミリーによって変化する細胞骨格タンパク質の発現の変化を同定し、現在論文作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の記載のように他の細胞種のコンタミネーションを可能な限り少なくするクオリティコントロールは概ね満足できるものが得られている。同時に計画通りに進まないときの検討として申請者らはすでにタンパク質脱アセチル化酵素SIRTファミリー分子を発現抑制することでOPCの成熟OLGへの分化効率が促進していることを見出しており、その際にOLG特異的細胞骨格分子の細胞内分布が変化していることを見出している。現在初代培養と並行してOLG株細胞の培養も行っており、この細胞にSIRTが関与した分化の過程、殊に髄鞘化に重要な細胞突起の伸長に関与していることを統計的に解析して有意差のあるデータを得ている。SIRTファミリーのノックダウンを行って形態の変化が著しいことを確認できたので、これと関連していると思われるOLGに特異的な細胞骨格蛋白、あるいは細胞骨格関連蛋白であるtubulin関連分子の発現や細胞内局在の変化を免疫染色、ウェスタンブロットなどで検討中であり、SIRTファミリーのオリゴデンドロサイトの分化への重要な関与が証明出来たと考えられた。ただ、有意なmiRNAの同定までには至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度はSIRTファミリーの強制発現、ないし発現の抑制により変化するmiRNAの同定を行うとデータの取りまとめが困難になると考えられるため、SIRTの制御によりオリゴデンドロサイトの形態が大きく変化してノックダウンによって成熟した細胞が促進的に形成されること、オリゴデンドロサイト特有の細胞骨格タンパク質の発現が制御されることと関連があること、SIRTファミリー間のシグナル経路に差異がある可能性が示唆されることをまとめて現在論文作成中である。
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| Causes of Carryover |
「研究実績の概要」「現在までの進捗状況」「今後の研究の推進方策」に記載したように2018年度にはmiRNAの検討をするに至らずこれに要すると考えられた外注による網羅的解析にかかると思われた経費が発生しなかった。追加実験に必要な培養に要する動物購入費、培地や消耗品の購入が当初計画より発生することが予想されその分を直接経費から捻出したい。
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