2018 Fiscal Year Research-status Report
ErbB4受容体切断の統合失調症発症における役割の解明
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17K07112
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
仲嶺 三代美 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20381105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鳥原 英嗣 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50757218)
山本 秀幸 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60191433)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Pyk2 / ErbB4 / Fyn |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニューレグリン1（NRG1）およびその受容体（ErbB4）は統合失調症の原因遺伝子として知られており、NRG1-ErbB4シグナルの低下が疾患発症に関与していると報告されている。これまでに私達はマウスの視床下部の培養神経細胞であるGT1-7細胞にNRG1とErbB4が発現していることを見出している。さらに、この細胞を用いてGタンパク質共役型受容体刺激（GPCR）の一つであるゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）受容体刺激によって２つのシグナル伝達機構が存在することを報告した。ひとつは、GnRH受容体刺激によって、ErbB4またはEGFRがトランスに活性化され、MAPキナーゼファミリーの中のERK（extracellular signal-regulated kinase）が活性化される機構である。もう一つは、GnRH受容体刺激によってErbB4が切断され、細胞膜上から減少し細胞質内にErbB4-80kの断片が蓄積する。結果としてErbB4-NRG1シグナルが抑制されることを明らかにした。GnRH受容体刺激後の細胞内シグナル伝達機構を詳細に解析することで、ErbB4の切断および活性化に関与するタンパク質が明らかになると考えられる。
本研究ではGT1-7細胞を用いて、GnRH受容体刺激後の細胞内シグナル伝達機構を詳細に解析する。また、モデル生物として小型魚類のゼブラフィッシュを用いて、ErbB4およびその活性化に関与するタンパク質のノックダウン胚を作成し表現型を解析する。これらによってGPCR刺激によるErbB4の切断および活性化と統合失調症発症との関与を明らかにすることをめざす。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GT1-7細胞ではGnRH受容体刺激によってErbB4は切断され、細胞質内にはErbB4-80k断片が蓄積することをウエスタンブロット法にて見出した。さらにGnRH受容体刺激によって、非受容体型チロシンキナーゼのPyk2（proline-rich tyrosine kinase 2）が活性化されることが分かった。Pyk2は主に神経細胞で発現し、シナプス機能に関与することが報告されている。また、近年、ハンチントン病モデルマウスの脳でその発現が低下していることが明らかとなり、疾患との関与が示唆されている。Pyk2はカルシウムイオンおよびジアシルグリセロールの増加によって活性化され、３カ所のチロシン残基がリン酸化（Y402, Y579/580）されるが、その詳細はよく分かっていない。活性化されたPyk2がErbB4の活性化へ関与することを検討する。GnRH受容体刺激によってPyk2のY402、Y579がリン酸化され、Pyk2の阻害薬の添加によりY402とY579のリン酸化がほぼ完全に抑制された。一方で、Srcファミリー阻害薬の存在下ではY402のリン酸化が部分的に、Y579のリン酸化がほぼ完全に抑制されることが分かった。さらに、抗Fyn抗体を用いた免疫沈降実験により、FynとPyk2が結合していることが分かった。以上の結果より、Pyk2のY402はPyk2分子間による自己リン酸化であり、Y579はFynによるリン酸化であることが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
１、ゼブラフィッシュを用いた解析：これまでの研究によって、ゼブラフィッシュのErbB4をノックダウンした初期胚は脳構造に異常をきたすことが明らかとなった。今後は、GnRH受容体刺激によって活性化することが明らかとなったPyk2について、そのノックダウン胚を作成し、表現型を詳細に解析する。
２、GT1-7細胞を用いたGnRH受容体刺激によるPyk2の活性化について：
GT1-7細胞へPyk2 cDNAを過剰発現させて、SrcファミリーおよびPyk2の阻害薬存在下でのPyk2の活性化について検討する。これまでのPyk2の過剰発現ではGnRH無刺激でもY402とY579がリン酸化されることが分かった。これらリン酸化部位をフェニルアラニンに置換した変異体およびキナーゼ活性を欠損させた変異体を作成し、GT1-７細胞へ過剰発現させて、Pyk2の活性化のリン酸化機構を検討する。
３、Pyk2のErbB4活性化への関与：
活性化したPyk2がErbB4の活性化に関与する可能性を検討する。Pyk2またはErbB4をGT1-7細胞へ過剰発現させ、抗Pyk2あるいは抗ErbB4抗体にて免疫沈降実験を行い、Pyk2とErbB4の相互作用を解析する。
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