2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K07115
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
大多 茂樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (20365406)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | MIF / 神経幹細胞 / ZFHX4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス神経幹細胞やヒト神経幹細胞培養系において、MIF（Macrophage migration inhibitory factor）がその細胞増殖能や幹細胞性維持に貢献することを長年明らかにしてきた。近年の研究成果により、CHD7, TPT1, SOX6などの因子がMIF下流において機能していることが判明した。今回、マウス神経幹細胞にMIFを作用させた際にZFHX4（Zinc Finger Homeobox 4）の遺伝子発現が増大することが明らかとなった。また、ZFHX4がマウス胎生期および成体脳で神経幹細胞発現部位においても発現していることから、ZFHX4の機能解明を神経幹細胞を中心として行うことにした。当該目的を達成するために、ゲノム編集技術を駆使してZFHX4ノックアウトマウスを作製した。さらに、作出した69個体をスクリーニングすることにより、各３系統のFloxマウスおよび単純ノックアウトマウス（標的遺伝子欠失体）を得ることに成功した。Floxマウスに関しては、戻し交配を経てホモ個体にライン化することができた。また、それら各系統に目的の遺伝子変異があるかについてもDNAシークエンシングにより確認を行った。単純ノックアウト体に関しては、成体ホモ個体を胎生致死のために得ることはできなかった。さらに、Nestin-Creマウスの繁殖も開始した。これらの結果、ZFHX4 Flox変異体とNestin-Creマウスの交配が実現可能となった。今後、これらのZFHX4 Floxマウスおよび単純ノックアウトマウスを用いて、神経幹細胞および神経発生における当該分子の機能に関して解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノム編集技術によりノックアウトマウスを作製する場合、オフターゲット効果や、予想外のゲノムローカスにおけるターゲットベクターのインテグレ―ション等のリスクが伴う。今回、それらの可能性を排除するためにスクリーングを行った結果、作出された69個体のうちより各３系統のFloxおよび単純ノックアウトマウス（標的遺伝子欠失体）を得ることに成功した。また、Floxマウスに関しては、ホモ体に交配させた後に遺伝子改変部のDNAシークエンスも行った。その結果、予測した通りの改変遺伝子配列を確認することができた。また、得られたヘテロ体単純ノックアウトマウスをホモ個体を得るために交配したが、胎生致死であることが判明した。このことは、当該遺伝子の重要性を示しているものと考える。Floxマウスと交配させる予定のNestin-Creマウス（理研より購入）を施設内で繁殖中でもある。以上のことより、当初の予定どうりにFloxシステムを用いてNestinエンハンサー・プロモーター依存的にZFHX4をマウス胎生期脳において破壊する準備が整った。また、Foxg1-Creマウスを導入するために、米国ソーク研究所とのMTA締結も終了した。これらとは別に、培養マウス神経幹細胞においてMIFの制御下でZFHX4が発現制御を受けうることをshRNAシステムで検証することができた。さらに、ヒトES細胞由来神経幹細胞において、MIF下流で制御されるmiR-338がZFHX4を標的とすることも新たに明らかとなった。このように、マウスおよびヒト神経幹細胞においてZFHX4の機能解析を行う準備が予定どうりに進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに作成したZfhx4 floxマウスおよびZfhx4 KO(+/-)マウスを繁殖させる。Zfhx4 KO (-/-)個体（単純ノックアウトマウス）は作出できなかったため、胎児での解析予定。計画のように、Nestin-CreマウスをZfhx4 floxマウスと交配させる。Nestin-Cre:Zfhx4 floxおよびZfhx4 KO(-/-)マウスを用いて、胎児期における神経幹細胞および新生ニューロンの動態を免疫組織化学方法(Nestin, Sox2, Pax6,Tbr2, Ascl1,Ki67等での染色)や初代神経細胞培養法を駆使して解析する。さらに、これらの胎児マウスを用いて、神経幹細胞制御シグナルMIF-CHD7-TPT1がZFHX4とどのように相互作用しているかを解明する（マウス胎児由来神経幹細胞において、MIFによりZFHX4が発現制御を受けうることを既に同定済み）。さらに、必要に応じてFoxg1-Cre（東大より譲渡予定）, Nestin-Cre/ER2マウス（理研より購入予定）をあらたに用いて、Zfhx4 floxマウスと交配させてZFHX4の機能評価を行う予定である。これらとは別に、ヒトES細胞由来神経幹細胞およびヒトグリオーマ幹細胞を用いてZFHX4の機能解析を分子生物学的手法を用いて実施する予定。
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[Journal Article] CHARGE syndrome modeling using patient-iPSCs reveals defective migration of neural crest cells harboring CHD7 mutations2017
Author(s)
Okuno H, Renault Mihara F, Ohta S, Fukuda K, Kurosawa K, Akamatsu W, Sanosaka T, Kohyama J, Hayashi K, Nakajima K, Takahashi T, Wysocka J, Kosaki K, Okano H.
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Journal Title
elife
Volume: 6
Pages: e21114
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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