2018 Fiscal Year Research-status Report

軸索遠位部に特異的な膜直下細胞骨格の形成機構の解明

Research Project

Project/Area Number	17K07118
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	吉村武大阪大学, 連合小児発達学研究科, 講師 (60402567)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	神経細胞 / 軸索 / 細胞骨格 / Spectrin / リン酸化
Outline of Annual Research Achievements	細胞骨格は建物の鉄骨の様な形態維持の役割を持つだけでなく、動的に様々な細胞機能に関わる。神経細胞の軸索遠位部には規則的に並んだ格子状細胞骨格が膜直下に構築されていることが2013年に超高解像度顕微鏡を用いた観察から新たに発見された。この構造は軸索特異的な構造であり、軸索先端から形成されることが知られている。しかし、軸索遠位部構造がどのような分子機構で形成されるのか理解されていない。申請者は、軸索先端で活性化されている蛋白質リン酸化酵素Cdk5および軸索遠位部骨格分子αII-spectrinに着目し、Cdk5がαII-spectrinをリン酸化することを見出した。本研究の目的は、Cdk5とαII-spectrinを足がかりにして、軸索遠位部に特異的な細胞骨格を形成する分子機構を解き明かすことである。平成30年度は、Cdk5によるαII-spectrinのリン酸化部位の同定するためにin vitroキナーゼアッセイを行った。リン酸化候補部位のセリン/スレオニンをアラニンに置換したαII-spectrin変異体を作製し、この変異体とRIラベルされたATP（[γ-32P]-ATP）、および精製されたCdk5を用いてin vitroキナーゼアッセイを行った。サンプルをSDS-PAGEで分離した後に銀染色を行い、オートラジオグラフィーを用いてリン酸化されたサンプルを検出した。そして、Cdk5によるαII-spectrinのリン酸化部位を同定した。次にリン酸化の生理的意義の解析を行う。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Cdk5によるαII-spectrinのリン酸化部位を同定できたため。
Strategy for Future Research Activity	αII-spectrinのリン酸化部位が同定できたので、リン酸化部位特異的抗体を作製する。αII-spectrinのリン酸化模倣変異体または非リン酸化型変異体を用いてKIF3/KAP3とのin vitro結合実験を行い、リン酸化がαII-spectrinとKIF3/KAP3の結合に与える影響を測定する。キナーゼ阻害剤を用いて軸索遠位部構造の形成が阻害されるか超高解像度顕微鏡を用いて観察する。非リン酸化型αII-spectrin変異体を発現する遺伝子改変マウスを作製し、αII-spectrinのリン酸化が軸索遠位部構造の形成に必須であることを証明する。
Causes of Carryover	本年度の実験は最大の山場であるαII-spectrinのリン酸化部位の同定を遂行できたが、前年度は計画通り進まなかったため全体として計画にずれが生じた。次にリン酸化の生理的意義の解析を行う予定である。